A. 免疫细胞分类及分离方法是什么
免疫细胞（immune cell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术
1、淋巴细胞的分离
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min 水平离心20min，管内分为4 层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次，每次2000r／min 离心10min，最后用RPMI l640 培养液将细胞配成2×106／m1 的细胞悬液备用。
2、T 细胞及B 细胞的分离
将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。
3、CD4 细胞及CD8 细胞的分离
（1）CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4 细胞。
（2）CD8 细胞分离：用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿内，4℃放置2 小时，用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。
4、单核巨噬细胞的分离
单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02 温箱内温育1 小时，然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。
B. 浜烘穻宸寸粏鑳炲垎绂绘恫镎崭綔protocol
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C. 求人外周血B、T淋巴细胞的分离方法
目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
方法:
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数
──────────×104×2(稀释倍数)
4
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率＝──────×100％
总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
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E. 请教：小鼠单个核细胞分离及Ficoll
单核细胞（monocytes）是体积最大的白细胞.其细胞核常偏位,呈多形性,如卵圆形、肾形、马蹄形、不规则形等,常有折叠感；染色质呈疏松网状,着色较浅.胞质较多,嗜碱性,但因含大量细小的嗜天青颗粒而染成灰蓝色,颗粒含过氧化物酶.血涂片,Giemsa染色 .
单个核细胞是指只有一个细胞核的细胞.一般医学检验书上说的是“外周血中单个核的白细胞”包括“淋巴细胞和单核细胞”.外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear
cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞和单核细胞.体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞,目前主要的分离方法是
Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法,因为血液中各有形成分的比重存在差异,因此得以分离.红细胞和
粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底.血小板则因密度小而悬浮于血浆中,唯有与分层液密度相当的单个核细胞密
集在血浆层和分层液的界面中,呈白膜状,吸取该层细胞递经洗涤高心重悬.本法分离单个核细胞纯度可达95%,淋巴细胞约占90%～95%,细胞获得率可达
80%以上,其高低与室温有关,超过25℃时会影响细胞获得率.