鱼粉组胺检测方法

① 组胺的组胺检测

大量食物易残留组胺类药物，对人体有一定危害。目前对于普通政府质检机构、兽药监察所、商检局等，以及食品企业：农畜产品加工出口企业、水产企业、蜂蜜企业等大众基层实验室，应用最多的是酶连免疫吸附试剂盒方法，即ELISA方法。
ELISA方法相比较于仪器检测具有灵敏度高、检测成本低、快速方便，可同时大批量筛选，操作简单等优点，因此举例： 1.1 仪器
(a)色谱管——200×7mm（内径）聚丙烯管，配有Kontes No.K-422,372Kel-F卡套和约45cm聚四氟乙烯管，以调节与柱相连的出口管高度，控制流速大于3ml/min。或用二通阀 （生物实验室产品）代替管子。
(b)荧光计——Perkin-Elmer型203或204,带中压汞灯。或带有在350nm激发光和在444nm测量发射光的仪器。
(c)重换移液管——1和5ml。
1.2 试剂
(a)离子交换树脂——Bio-Rad AG/-X8 50—100目。或Dowex 1-X8 50—100目，以约15ml 2M NaOH/g树脂加入烧杯，使其转变为—OH形式，旋摇混合，静置30min。倒出液体并加碱重复操作。用水洗透树脂，糊状物倒进折叠滤纸，再用水洗。每周制备新树脂并浸在水中保存。
在管(a)底塞上玻璃棉，填入足以形成8cm树脂床层的糊状物，无论何时，都须使树脂层上保留水层。再生树脂，不在填充柱内进行，需要时，可在烧杯里分批再生，每次提取前，用约10ml水洗柱。
(b)磷酸——1.19M。稀释121.8ml、85%的H3PO4至1L。如用其他浓度磷酸，配1L 1.19M的H3PO4所需体积V=17493/（密度H3PO4×%H3PO4)。标定；吸取5ml H3PO4,以酚酞为指示剂用1.00M NaOH滴定至终点。如需要，可调整浓度。
(c)邻苯二甲酸二碳基乙醛(OPT)溶液——0.1%。100mg OPT溶于100ml、经玻璃容器蒸馏过的甲醇中，装在棕色瓶中，于冰箱内贮存，每周新配。
(d)组胺标准溶液——冰箱里贮存。
⑴ 贮备液——1mg/ml。无碱性。准确称取约169.1mg组胺·2HCl(98%）于100ml容量瓶中，用0.1M HCl溶解并稀释到刻度，每周新配。
⑵ 中间溶液——10μg/ml。吸取1ml贮备液放进100ml容量瓶，用0.1M HCl稀释到刻度，每周新配。
⑶ 工作溶液——0.5,1.0和1.5μg/5m1。吸取1,2和3ml中间溶液，分别于100ml容量瓶中，各用0.1M HCl稀释至刻度，每天新配。 （使用前，以HCl(1 3)和水洗涤全部塑料及玻璃容器）
2.1.标准曲线的绘制
吸取平行的各标准工作液5ml于50ml的玻璃或聚丙烯锥形瓶中，各瓶加10ml 0.1M的HCl并混匀。加入3ml 1M NaOH并混匀；在5min内，加入1ml OPT溶液并立即混合；准确于4min后，加入3ml 1.19M H3PO4并立即混匀。每次加液后，至少在OPT反应期间（顺序加入试剂到一组锥型瓶里，可同时进行6—10个OPT反应），充分混匀是很重要。用5ml 0.1M HCl代替组胺溶液作为空白，在1.5h内，以水为参比记录工作标准液的荧光强度(I)，用350nm吸收波长，和444nm发射波长，以(I)（经空白校正）对μg组胺/5ml试样作图。
2.2.测定
用甲醇萃取按17-28C,第一节中制得的样品。用4—5ml水洗柱，(a)，弃流出液。吸1ml萃取液加进柱内并加4—5ml水。立即使柱流出液进入50ml、内含5.00ml 1.00M HCl的容量瓶中，当液面在树脂上方约2mm处时，加入约5ml水洗脱，接着用大量水洗脱，直到约有35ml洗脱液为止。停止柱流，用水稀释到瓶的刻度，塞上瓶盖混匀，冷藏洗脱液。
吸5ml洗脱液于50ml锥型瓶中，吸取10ml 0.1M HC1加入，按C,自吸加3ml 1M NaOH开始进行。
如样品含量大于15mg组胺/100g鱼，吸取1ml样品-OPT混合液于10ml、盛有准确2ml空白-OPT混合液的烧杯中，充分混匀。读出新溶液的荧光强度，如想得到可测的读数，就用空白-OPT的混合液稀释试样。这个近似值表明，为准确地定量样品，进行第二次OPT反应前，要将洗脱液作适当稀释。此外，调节荧光计的灵敏度范围（如仪器有此装置）来估计稀释倍数。利用这些近似值，用0.1M HCl制备洗脱液的适当稀释试样。按C进行。
2.3.计算
绘制I对μg组胺/5ml溶液（用绕度（偏转）计或记录仪响应测量并经空白校正过的图应是一条过原点的直线，斜率=m=[(Ia/1.5)十Ib十2Ic]/3mg组胺/100g鱼=⑽(F)(1/m)(Is)
式中：Is、Ia、Ib、Ic分别为样品、1.5、1.0和0.5mg组胺标准的荧光强度。F=稀释倍数=ml洗脱液十ml 0.1M HCl/ml洗脱液，未稀释的洗脱液F=1
如果校正图形呈非线性，直接用标准曲线定量。横坐标上每一分度应≤0.1μg组胺/5ml溶液，从曲线最靠近0.05μg组胺/5ml溶液处，读出所有值。
mg组胺/100g鱼=⑽(F)(W)
式中：W=μg组胺/100e鱼（用标准曲线测得）

② 求鱼粉中组胺的检测方法

组胺检测方法原理本测试盒的原理是是竞争性直接酶联免疫吸附剂测定法(CD-ELISA), 可准确检测出样品中ppm级的组胺。样品和标准对照液中游离的组胺与酶结合物中的组胺竞争抗体结合位置。清洗后，加入底物，底物与酶结合物反应出现兰色，兰色越深表明组胺越少。将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以对照标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中组胺的准确浓度。 已提供的材料1. 48个包被了抗体的孔。2. 48个红色标记的混合孔。3. 6瓶黄色标记的组胺标准对照溶液：0、2.5、5、10、20、50ppm六个浓度，每瓶1 ml。4. 1瓶兰色标志的组胺—HRP酶结合物溶液。5. 1包内含10mM PBS（丁苯橡胶）干粉的稀释试样提取液的浓缩缓冲液。6. 1瓶 40ml冲洗缓冲浓缩液，内含10mM丁苯橡胶—Tween。7. 1瓶绿色标志的K—兰色底物溶液。8. 1瓶红色标志的终止液。未提供的必需材料1. 提取材料（Neogen公司的产品号为9510）a. 去离子水或蒸馏水b. 125ml的瓶子c. 1号Whatman滤纸，Neogen公司过滤注射器或其他相当品d. 样品收集试管2. 100ml量筒。