池塘底中弧菌检测方法

1. 霍乱弧菌的检测方法

根据弧菌O抗原不同，分成Ⅵ个血清群，第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型：含AC者为原型（又称稻叶型），含AB者为异型（又称小川型），A、B、C均有者称中间型（彦岛型）。
1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株，推荐使用天津生物芯片生产的霍乱弧菌诊断血清。 1,普通聚合酶链反应法
核酸扩增技术，即聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。一般选择霍乱肠毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作为靶基因。一些非产毒株(如环境来源的菌株)有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表达调控基因(toxR)等也被选用为PcR的靶基因，这大大提高了检测的特异度.
2 ,多重PCR法
与常规PCR相比，多重PCR一次反应可检测多个基因，节省了时间和成本。国内、外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、tcp与其他基因如ompW、rfb、hly进行组合，作为共同的靶基因，克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重PcR同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株，可谓一举多得，大大提高了检测效率。
3.荧光定量PCR法
荧光定量PCR自动化程度高、特异性强、无交叉污染，在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来，随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光PCR仪的开发与广泛使用，多重荧光定量PCR技术日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为应用的热点. 与PCR方法相比，基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息，从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析，对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。但基因芯片成本较高，距离推广应用尚需时间等待 。

2. 霍乱弧菌国家规定是否属于强制性检验范围，又是如何检验的（检验方法），在动物上是否有疫苗；

霍乱弧菌检查常规方法是：直接涂片、染色检查、动力观察制动试验。
检查过程
(1)、增菌称取检样25g，加入装有225mL碱性蛋白胨水(APW)的广口瓶内。固体样品应以均质器9000r/min-10000r/min打碎，或以剪刀充分剪碎。(36±1)℃培养6h-8h和16h-24h。如为牡蛎样品，应同样制备另一份检样，置于APW中，42℃培养6h-8h和16h-24h。(2)、分离以3mm-5mm接种环取6h-8h和16h-24h增菌培养液的表面生长物一环分别划线家终于TCBS琼脂平板至少各一个，于(36±1)℃培养18-24h。在TCBS琼脂上，典型的霍乱弧菌菌落为大的，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。(3)、初步鉴定① 用接种环挑取TCBS琼脂平板上2-5个可疑菌落，划线于T1N1琼脂平板上，(36±1)℃培养12h-18h。② 以无菌白色滤纸沾取T1N1琼脂表面培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。③ 以无菌环取氧化酶阳性的培养物于0.5%去氧胆酸钠液试剂滴中，进行粘丝试验。④ 以接种针取氧化酶和粘丝试验阳性的培养物，接种TSI、KIA和AGS，穿刺底层并划线斜面。⑤ 以接种针取上项相同培养物接种T1N0和T1N3肉汤。⑥ 将TSI、KIA、AGS、T1N0和T1N3肉汤于(36±1)℃培养18h-24h。
目前正在接受WHO预审的两种口服霍乱疫苗，均是灭活全细胞霍乱弧菌血清群O1疫苗：Shanchol疫苗还含有霍乱弧菌血清群O139；而Dukoral疫苗（Crucell）含有重组的霍乱毒素B亚单位。
实际应用中，Dukoral疫苗短期内（6个月）可提供84%的保护作用，并已在亚洲、非洲成功应用；而Shanchol疫苗效能仅在印度Kolkata试验条件下检验过，其实际临床应用的有效性仍待进一步确定，且该试验是对疫苗的长期（接种后2、3和5年）保护作用进行评估，其接种后第一个月的免疫效果仍不清楚。