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② 血清中细胞因子可不可以用western来检测
理论上可以，但前提是你待测的细胞因子一定是一种蛋白质。
Western Blotting中文名称是蛋白质免疫印迹法，是将蛋白质通过电泳分离，然后再通过电泳转膜印迹在PVDF膜上，用抗体标记之后再曝光于胶片上。因此只要是蛋白质，而且能买到相应的抗体，就能通过Western Blotting来检测。
我看过一篇文献，文章名为：Western Blotting测定血清抗组蛋白亚成份抗体。你从数据库下载看看吧，也许有帮助。需要的话QQ联系：806054703。
③ 抗体检测怎么检测（核酸、抗原、抗体检测）
自 2020 年新冠疫情爆发以来，“核酸检测”作为一项检测是否感染的重要指标，开始反复出现在我们的生活中。2022 年 3 月 10 日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组发布通知，决定推进“抗原筛查、核酸诊断”的检测模式，在核酸检测基础上增加抗原检测作为补充。
抗原检测是什么？和其他的检测手段有什么不同？这篇文章，我们以新型冠状病毒为例，讲讲常见的快速筛查手段，聊聊相关的原理以及适用范围。
想要对一种疾病或是一种物质进行筛查，我们首先要弄清楚的就是“从何下手”的问题，其次是“如何检测”，让微观世界的变化反映到我们眼前，帮助我们作出判断。
我们面对的是病毒。根据大家耳熟能详的中学生物课知识，病毒是一类由遗传物质和蛋白质外壳组成的类生命体 。如果想对病毒的感染情况进行探测，就需要从它的组分下手。接下来的内容，希望大家带着自己中学的生物知识阅读。
以目前正在困扰我们的 SARS-CoV-2 为例。它属于冠状病毒科下，冠状病毒亚科的乙型冠状病毒属，是已知的第七种能够感染人类的冠状病毒。所有的冠状病毒都是具有 包膜 的 正义单链 RNA 病毒 ，也就是说，它们的遗传物质是一条单独的 RNA 链，并且这条 RNA 链可以直接作为 mRNA（信使 RNA）参与翻译，指导蛋白质的合成。
编号为NPRC 2020.00002的毒种，图片由国家病原微生物资源库（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所）提供。
我们现在的目的是检测标本中是否存在这种病毒，无论是检测它本身，还是检测病毒带来的产物，能够下手的方向也就是两种：蛋白质外壳（包膜）、遗传物质。
顺着这个逻辑，那最显而易见的方法就是检查它“能不能看到”，但病毒本体小得很，SARS-CoV-2 的直径在 80-120 nm，要想每个标本都拿电镜过一遍是不现实的，人力物力和财力都撑不住。那么更经济实惠的方法，就是通过某些措施，让 病毒的组分 ，或是因为病毒而出现的 某些特殊物质 积攒到一定数量级后发光、变色，出现 宏观表现 。
那么我们的问题就转化成了，选择一种可以观察到宏观尺度变化的方法，和病毒的组分、病毒引发的某种物质产生关联。我们能选择的物质也摆在台面上：病毒的遗传物质，在这里是它的 RNA；病毒的包膜，也就是蛋白质外壳；以及，如果你还记得一些基础的生物知识，人体的免疫系统会在感染病毒之后产生抗体以抵抗入侵，它也是不错的选材。
我们目前采用的几种检测方式，也就从这些物质（以及它们的相关物质）脱胎而来，分别为针对遗传物质的核酸检测，针对包膜的抗原检测，以及针对抗体的血清抗体检测。
作为病毒的遗传物质，核酸序列载写了能够鉴定病毒为某一特定种的基因特征，因此核酸阳性，也就意味着病毒在体内存在过。
我们目前进行的“核酸检测”其实分为两个部分。平常我们进行的“捅鼻子”“捅嗓子”取样和后续的定性是第一部分。在取得标本之后，因为病毒量太少，样本会在实验室中进行一定次数的扩增，并根据荧光反应结果来判定阳性阴性。
第二部分，确定为阳性的样本，还需要通过基因测序，确定样本病毒的分型，以便溯源。这一步已经不属于日常筛查的范畴，但在流行病学调查上具有重大意义，如果有兴趣了解，可以参看 Wikipedia 简要了解。
我们平常参与的作为 筛查 工具的核酸检测，指的就是采集到定性的第一部分。
在感染了 SARS-CoV-2 之后，咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液等标本中均可发现病毒核酸。不同部分标本核酸检测的阳性率有一定差异，随着病程进展，各个部位的检出率也会发生变化。
我们习惯称呼的“鼻拭子”与“咽拭子”，其实都是采集咽腔后壁的分泌物与组织，前者采集鼻咽，后者采集口咽。也有采用其他标准的，比如唾液等亦可作为检测标本，本质上也是不同地区规定有差异
鼻（咽）拭子与（口）咽拭子已经是综合了阳性率与便利程度的考量。粪便和尿液等其实也可以作为标本采集的对象。而且根据一项对 31 例患者的研究，肛拭子的准确率要高于鼻咽与口咽采样，尤其病程后期，肛拭子确诊病例的鼻拭子阳性率不到 30%。 4 但显然，由于操作的限制，它无法作为早期筛查的首选手段。
接下来的工作，就是从获取的那一点点标本中提取核酸。由于样本中病毒的数量级很小，不足以拿来分析，还需要将其扩增并标记。需要用到的同样是高中学过的知识：聚合酶链式反应（PCR）——这一步看起来麻烦，但由于它的原理和工序已经研究成熟，实际操作中只需要加好试剂送机器，整个核酸检测的过程里最麻烦的还是让待测者安安分分弄来标本（笑）。
各地疾控机构或检测中心会采购合适的核酸 提取试剂盒 与核酸 检测试剂盒 。提取试剂盒负责将 RNA 从混杂的样本（细胞碎屑、分泌物、灰尘等杂质）中提取出来，常见的有磁珠法、离心柱法和释放剂法，不同提取方法可能对后期检测的准确度略有影响 。之后，提纯出的 RNA 就会移交给检测试剂盒（也有一些试剂盒将两者合一），进行之后的工序。
检测试剂盒带着样本在机器中进行的过程，就是这个检测中最主要的反应：RT-qPCR（实时定量逆转录聚合酶链反应）。
接下来需要你捡起高中生物的知识。一般的 PCR 反应有以下几步：
加热：让双链 DNA 解旋变形，成为两条单链； 退火：让混合的单链 DNA 与根据需要复制的片段而设计好的引物结合； 延伸：调整温度，让 DNA 聚合酶顺着引物开始工作，复制出新链，形成新的双链。在对病毒的探测中，我们要做的工作也无非上面几步，只是需要多出两样东西：
在第一次反应之前，使用 逆转录酶 （依赖 RNA 的 DNA 聚合酶），合成病毒单链 RNA 的互补链，组合成 cDNA ； 在退火与延伸的阶段，除了引物和所需的酶外，还需要 TaqMan 探针 。你可以把 TaqMan 探针这样理解：它的主体部分是一段寡核苷酸链，被设计成能和一小部分需要复制的基因片段配对成双链的样子；它一端接了一个荧光分子，另一端接了一个开关（淬灭基团），两者和探针相连时，荧光就会被淬灭基团压制，探测不到。退火时，这个探针会和引物一起结合在要复制的单链片段上。在延伸的过程中，DNA 聚合酶会把挡在面前的障碍物切碎，其中就包括这段探针，淬灭基团和荧光分子就这样分离，荧光就表现出来。
随着循环数的增多，扩增的 DNA 片段和荧光也越来越多。对比每个循环的荧光亮度和前若干次循环的基准亮度，我们就能得出目前的 DNA 片段量，也可以直接用循环数和荧光亮度做定性的判断。
那么具体复制哪一部分呢？既然要探测病毒，那我们就选取最有代表性的核酸片段。现行的标准中，ORF 基因与 N 基因是常用的检测位点。
检测试剂盒负责的就是将提取出的 RNA（样本）投入后，根据试剂盒上的程序说明，设定对应的 PCR 温度与时长，由机器控制完成扩增过程，在固定的环节收集荧光信号，记录对应的循环数（Ct 值）。判断阴性阳性 / 是否还具有传染力的标准，就是看荧光信号达到阈值时，目前循环数是多少。根据目前现行的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》，解除隔离管理的标准为 Ct 值 ≥ 35 。和此前通行的 ≥40 标准相比，出院与解除隔离的时间会大大缩短 。
经 RT-PCR 的核酸检测到现在都是确诊的金标准，因为它在方法学的角度看来，（理论上）可以做到 100% 准确。但核酸检测耗时长、对环境与操作人员要求高，在环境条件达不到标准、物资与仪器不齐全等情况下，大批量的核酸检测会带来巨大人力与财力消耗。
在本次疫情中，我们采用的免疫测定包括了快速抗原检测与抗体检测，它以 抗原-抗体反应 为基本原理，旨在通过抗原与抗体快速的中和效应，以较少的时间成本探测样本中是否存在待测物。两者都属于免疫层析法的范畴。
以盒装方式出现、可以自行操作的抗原检测就很适合作为物资不足、自我测定等情况下的补充。
核酸检测检查的是病毒的（标志性）遗传物质，是病毒的“内里”。那么（快速）抗原检测检查的就是病毒的“外在”，直接检查完整的病毒颗粒。目前通过审批的抗原检测试剂盒包括三种类型：胶体金法、乳胶法、荧光免疫层析法。三者内在原理一致。但其中荧光免疫层析法试剂盒仍然需要专用的检测仪或紫外线手电，不适合家庭自测；胶体金法和乳胶法则都是将检查结果转化成肉眼可见的条带，差别在于用于标记上色的物质不同。
当然，抗原检测自然有它的劣势在，它的 假阴性率 （是阳性但显示阴性）要更高，可能导致漏检错检。但放在一杯茶就能出结果的时间优势面前，准确性上的差距在某些特定情况下可以暂时让步。
图源：How the SARS-CoV-2 EUA Antigen Tests Work | ASM.org
和核酸检测相比，抗原检测增加了“鼻拭子”这一采样途径，降低了个人自测的难度。拭子上的样本在缓冲液中洗脱，取液体滴加在加样孔后，液体会因为毛细作用，带着潜在的抗原，经过一片预载了抗体的区域（结合垫，conjugate pad）。
这片区域上的抗体，是抗目标抗原（SARS-CoV-2）的单克隆抗体，每一个抗体分子都和特别的标记结合，它们与样本中的抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物，并随着毛细作用向下一条带流去。
紧接着经过的是检测线（T 线，test line），在检测线上附着的同样是抗目标抗原的单克隆抗体，你可以理解成这里的东西和结合垫上的一样，只是没带标记。此时，如果受测者已经感染了 SARS-CoV-2，他留在样本中的抗原形成的抗原-抗体复合物，会在此处与固定在线上的抗体再次结合。在这里，这些带着标记的复合物不断沉积，最终会显示出一条或深或浅的条带。条带的颜色来源，就是之前结合垫上的抗体分子附着的标记，在胶体金法中是胶体状态的金颗粒，在乳胶法中是上色的乳胶滴，在荧光法中是荧光分子。所以你在使用这类试纸时，会发现刚刚加样结束，液体刚开始扩散的时候，扩散的最前端会有一点点很淡的颜色不断推移，这就是还没有固定沉积的标记的颜色。
接下来，液体继续扩散，经过质控线（C 线，control line），在质控线上附着的是另一种抗体——‘抗“抗目标抗原的单克隆 抗体 ” 的 单克隆 抗体 ’，简称“ 二抗 ”。这种新的抗体是让上一种抗体在另一种动物的免疫系统中反应得来的，比如结合垫的抗体来自兔，那这里的抗体就来自羊，是羊抗兔的单克隆抗体。也就是说， 二抗的抗原是 之前在 结合垫上的抗体 。这条线就是为了检测液体有没有正常扩散、结合垫上的抗体有没有失效等等而存在的。此时，液体中剩余的大量来自结合垫的抗体就会作为抗原，与质控线上的二抗发生抗原抗体反应，形成复合物，显出一条明显的条带。
由于结合垫上的抗体非常充裕，这条质控线条带会出现得非常快、非常显色，而检测线由于抗原（病毒）数量不一定，显色速度会有差别，但一般在 15 分钟内就足够判断结果。所以不要看 C 线很明显，T 线隐隐约约就觉得“没事了”， T 线不管深浅，只要有，就是阳性 。
具体操作方面，可以参考医政医管局发布的 教学视频。目前国家也在逐步推广抗原自测试剂盒，在一定程度上可以减轻未来医疗与街道的压力。
除了前两种检测手段外，还有一种使用不太多，但同样重要的检测方法，就是同属免疫测定方法的“血清抗体检测”。
抗体检测采用的试剂盒与抗原检测非常接近，但标本的限制更大——由于检测的对象变成了抗体，标本就必须是明确有抗体存在的血液（或血浆、血清）。而且人体在初次感染病毒后，并不会第一时间内产生抗体。抗体能够明确达到被检测的数量级，一般是在初次感染（或接种疫苗）的一到两周之后。这些条件限制了抗体检测不能作为确诊性质的检查。目前，血清抗体检测仅作为一定情况下检查疫苗是否生效，或查验受测者近期是否感染过新冠病毒的方法。
在人体中有五种抗体，分别是 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。IgA 主要负责黏膜免疫。IgD 与免疫反应激活有关。IgE 抵御寄生虫，同时也参与过敏反应。剩下的 IgG 与 IgM 就是对抗病原体的过程中，免疫系统派出的主力军。
SARS-CoV-2 作为病原体，人体经刺激主要分泌的就是 IgG 与 IgM 两种。现有的抗体检测试剂盒，主要也是针对人体对 SARS-CoV-2 的 N 蛋白（核衣壳蛋白）或 S 蛋白（刺突蛋白）产生的 IgG 与 IgM。
抗体试剂盒的检测装置外观和抗原检测别无二致。二者的差别就是上文中提到的结合垫、检测线、质控线上附着的物质。
这次，加样孔中滴入的样本可能有对 SARS-CoV-2 的抗体。因此，结合垫上就应当是带了标记物的抗原——当然不可能放活病毒上来。一般这里使用的都是设计检测的抗原蛋白，比如前文提到的 N 蛋白或 S 蛋白，或是重组病毒，无论是哪种，它都必须包含受体结合域（RBD）作为抗体结合的靶点。在检测线上，附着的就是抗 IgM 或抗 IgG 抗体，以捕获结合了抗原的抗体蛋白。最后，质控线上附着抗原的特异性抗体，捕获剩余的游离抗原。
总的说来，三种检测方式针对的是不同的需求，互有优势，互相补充。核酸检测作为金标准，直接查验病毒的 RNA，负责看被检者带不带病毒；抗原检测作为快速检测方法，查的是病毒的蛋白质，但准确度不如核酸检测，对传染力强的感染者更有效；抗体检测查的是疫苗有没有生效、人近期有没有感染过病毒。
近期，新冠疫情在各地卷土重来。Omicron 变种与此前流行的 Delta 变种相比，虽然病死率与重症率明显下降，但潜伏期更短，病毒复制速度更快，传染力明显增强。希望大家在这样的环境中保持健康。
④ 免疫检测方法
免疫检测方法大全2017
免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反应、自身免疫病、移植排斥反应肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有很大帮助。此外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对各种免疫学现象的研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。本章仅介绍常用免疫学检测方法的原理，简要过程和实用意义。下面是我为大家带来的关于免疫学检测法的知识，欢迎阅读。
第一节抗原或抗体的检测
一、检测的原理
借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。
1.抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。
2.抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。
对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。
(1)根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原(或抗体)的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体(或抗原)的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原(或抗体)量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原(或抗体)的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。
(2)抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反应成分(抗原或抗体)的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度(如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高)。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清(抗原)和抗体(免疫兔血清)相比，浓度高，故应稀释抗原。
二、抗原或抗体检测的实用意义
1.抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体，对有关疾病的诊断有重要意义。
2.抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类：
(1)各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。
(2)生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白(如各类免疫球蛋白、补体的各种成分)、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。
(3)人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。
(4)各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人在服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。
三、抗原或抗体检测的方法
由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种：
(一)沉淀反应
可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应(precipitation neaction)。
1.环状沉淀试验先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验(ring precipitationtest),此法简便易行，需用材料较多是其缺点。
2.单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验(single immunodiffusion)是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度(最低浓度)约为10～20μg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果
3.免疫比浊法 当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法(immunonephelomytry)就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计(nephelometry)测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。
4，双向免疫扩散试验 双免疫扩散试验(double immunodiffusion)是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。
5.对流免疫电泳对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。
6.免疫电泳 免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义
7.免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting)又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上(电印迹)，然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物(如果抗人Ig是用酶标记的)或做放射自显影(抗人Ig用125Ⅰ标记)以显示结果
第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离;
第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上;
第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上;
第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上;
第五步：加入显色底物(或放射自显影)显现第二抗体
(二)凝集反应
细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应(agglutination)。
1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应(Widal reaction)诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。
2.间接凝集 间接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用γ球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊液混合，便可发生凝集，可进行快速诊断。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。
3.抗球蛋白试验 抗球蛋白试验(antiglobulin test,coombs test)的原理为间接凝集试验。例如应用于诊断自身免疫溶血性贫血症时，Rh+红细胞与抗Rh血清间的反应。因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小(不如IgM结合价多，分子大)很难直接引起Rh+红细胞凝集。如果加入抗IgG的抗体，就可帮助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经抗Ig的作用提高凝集反应的'灵敏度。
(三)补体参与抗原抗体反应
这一类反应主要包括溶血反应(hemolytic assay)、补体介导的细胞毒试验(complement mediated cytotoxicuty test)及补体结合试验(complement fixation test)。
1.溶血反应 抗体与红细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中的补体活化，导致红细胞溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测，此法比凝集反应敏感。溶血反应也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细胞(PFC)检测的原理。
2.补体介导的细胞毒试验各种有核细胞与针对其表面抗原的抗体相遇，所形成的免疫复合物能活化反应中的补体，引起细胞膜穿孔，在一定时间内，细胞仍能维持一定的形态不破碎，加入水溶性染如伊红Y(eosin Y)或台盼蓝(trypan blue)后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带相应抗原细胞膜保持完整的活细胞不着色。此方法可用于带各种抗原的细胞的检测，如进行细胞MHC抗原的鉴定，和进行淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。在一些免疫学实验中也可用这种方法，根据需要特异地消除带某种抗原的细胞。
3.补体结合试验当抗原(可溶性或颗粒性)与相应抗体结合，由于浓度低不出现可见反应时，应用补体结合试验可检出此抗原抗体反应，它比凝集反应或沉淀反应灵敏度高。本法包括两个抗原抗体系统。一为检测系统由待检样品与已知抗原(或抗体)组成;另一为指示系统，由绵羊红细胞(SRBC)和抗SRBC组成。另加入作为补体的新鲜豚鼠血清。试验时试管中先加入检测系统和补体，混合经37℃30分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再加入指示系统，如出现溶血现象，说明检测系统中没有相对应的抗原抗体，补体是游离的指示系统的SRBC和抗体结合而出现溶血，即为反应阴性。如不出现溶血，表明检测系统中有抗原抗体复合物并结合补体，则指示系统无多余的补体作用而没有溶血现象，即为阳性。
在敏感的抗原、抗体检测方法(如酶标方法)出现之前补体结合试验曾广泛用于检测各种细菌、病毒或螺旋体(如梅毒)的抗原或抗体，由于本试验影响因素多，结果不稳定现已被新检测方法所代替。
四、用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反应
用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。
1.免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescence techni)是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。
(1)直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞(如T细胞和B细胞)或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。
(2)间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体(不标记荧光)结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体
免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素(FITC)发黄绿荧光，用罗丹明(TMRITC)发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。
2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：
(1)液相法：将待检标本(例如含胰岛素抗原)与定时的同位素标记的胰岛素(抗原)和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量
(2)固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰(CNBr)海豹化的纸片或聚苯乙烯小管
放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种激素(胰岛素、生长激素、甲状腺素等)维生素、药物、IgE等。
3.酶联免疫分析法 酶联免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶(alkaline phosphatase)等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原;后者主要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法更易推广。
(1)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是与上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行政区。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
(2)夹心法(sandwich assay):将已知的特异抗体包装在固相载体(塑料板凹孔或纸片上)，加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法(indirecr ELISA)常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本(可能含有相应抗体)，再加入酶标抗Ig的抗全(即第二抗体)，经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
(3)BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素(avidin)分子可以结合4个生物素分子(biotin)。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。
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