松材线虫分子检测方法有哪些

① 松材线虫病的鉴别特征

1、测量数据：雌⒇：L=1140µm；a=39.4；b=11.1；c=27.3；v=72.9%；st=15.2 µm；雄⒇：L=1070µm；a=47.6；b=11.0；c=31.3；st=15.1 µm；sp=29.8 µm 2、雌雄虫都呈蠕虫形，虫体细长，长1mm左右。唇区高，缢缩显着。口针细长，其基部微增厚。中食道球卵圆形，占体宽的2/3以上，瓣膜清晰。食道腺细长叶状，覆盖于肠背面。排泄孔的开口大致和食道与肠交接处平行，半月体在排泄孔后约2/3体宽处。卵巢单个，前伸；阴门开口于虫体中后部73%处。上覆以宽的阴门盖。后子宫囊长190µm，约为阴肛距的3/4。雌虫尾亚圆锥形，末端宽圆，少数有微小的尾尖突。雄虫交合刺大，弓状，成对，喙突显着，交合刺远端膨大如盘。雄虫尾似鸟爪，向腹面弯曲，尾端为小的卵状交合伞包裹，退火的交合伞在光学显微镜下不易看见，交合伞（为翼）是尾的角质膜的延伸，在问短呈铲状，由于边缘向内卷曲，从背面观呈卵形，从侧面观呈尖圆形。病材中的幼虫虫体前部和成虫相似，但其后部则因肠内积聚大量颗状内含物，以至呈暗色并接结构模糊。幼虫尾亚圆锥形。

② 拟松材线虫与松材线虫的形态区别

最主要的区别是尾部的尾尖突不同：

二者在形态上的区别专业描述

拟松材线虫都有尾突，长度比松材线虫略长，但实际操作中，这个特征很难把握，近些年来逐步发展起来了许多新技术和方法，其中PCR技术被作为形态学鉴定的辅助手段，对于鉴定那些形态特征不够典型的松材线虫或拟松材线虫以及幼虫有很大的帮助，有助于快速准确地鉴别松材线虫。

由于分子检测过程繁琐，且需要专业的分子生物学技术基础，集成了该检测技术的松材线虫自动化分子检测系统可以自动检测，避免人为因素影响检测结果。

③ 松材线虫的发生规律如何怎样防治

（1）发生规律松材线虫病多发生在每年7～9月份。高温干旱气候适合病害发生和蔓延，低温则能限制病害的发展；土壤含水量低，病害发生严重。传播松材线虫的主要媒介是松墨天牛。松墨天牛一般5月前后羽化，从罹病树中羽化出来的天牛几乎100%携带松材线虫，天牛体内的松材线虫均为耐久性幼虫，这阶段幼虫抵抗不良环境能力很强，它们主要分布在天牛的气管中，每只天牛都可携带成千上万条线虫，最高可达28万条。当天牛在树上咬食作补充营养时，线虫幼虫就从天牛取食造成的伤口进入树脂道，然后蜕皮成为成虫。被松材线虫侵染的松树往往又是松墨天牛的产卵对象。翌年，在罹病松树内寄主的松墨天牛羽化时又会携带大量线虫，并“接种”到健康的树上，导致病害的扩散蔓延。病原线虫近距离由天牛携带传播，远距离则随调运带有松材线虫的苗木、枝丫、木材及松木制品等传播。松树线虫雌雄虫交尾后产卵，每雌虫产卵越100粒。虫卵在温度25℃下30小时孵化，幼虫共4龄。在温度30℃时，线虫3天即可完成一个世代。松材线虫生长繁殖的最适温度为20℃，低于10℃时不能发育，28℃以上繁殖会受到抑制，在33℃以上则不能繁殖。（2）防治方法①严格检测制度，禁止疫区的苗木、木材、木制品、枝丫、锯片等运往非病区。
②清除病害的枯木或濒于枯死的树木，集中成堆，用塑料布密封，以溴甲烷熏蒸5～10小时，药量为69～83克/米3，可杀灭天牛成虫及幼虫。树丫集成小堆烧毁。也有用天牛化学引诱剂Ⅰ号诱杀天牛或养放肿腿蜂（Scleroderma guani）寄生天牛幼虫诛杀。
③预防性喷药，喷药一次可持效2.5～3个月。可用25%杀螟松乳剂，每公顷3～3.6千克。

④ 在野外如何识别松材线虫病，该病害在普查和调运检疫中的取样和鉴定方法

野外识别是看是否出现松树枯死、针叶褪色、黄化、枯萎以及呈红褐色等松针变色症状等异常情况。取样鉴定是否发生松材线虫病。

取样方法和鉴定方法具体参照最新《松材线虫病防治技术方案》指导：

（三）取样。

1.取样对象。抽取尚未完全枯死或者刚枯死的松树，不应当抽取针叶已全部脱落、材质已腐朽的枯死树。可参照以下特征选择取样松树：

——针叶呈现红褐色、黄褐色的松树；

——整株萎蔫、枯死或者部分枝条萎蔫、枯死，但针叶下垂、不脱落的松树；

——树干部有松褐天牛等媒介昆虫的产卵刻槽、侵入孔的松树；

——树干部松脂渗出少或者无松脂渗出的松树。

2.取样部位。一般在树干下部（胸高处）、上部（主干与主侧枝交界处）、中部（上、下部之间）3个部位取样。其中，对于仅部分枝条表现症状的，在树干上部和死亡枝条上取样。对于树干内发现媒介昆虫虫蛹的，优先在蛹室周围取样。

3.取样方法。在取样部位剥净树皮，用砍刀或者斧头直接砍取100-200克木片；或者剥净树皮，从木质部表面至髓心钻取100-200克木屑；或者将枯死松树伐倒，在取样部位分别截取2厘米厚的圆盘。所取样品应当及时贴上标签，标明样品号、取样地点（需标明地理坐标）、树种、树龄、取样部位、取样时间和取样人等信息。

4.取样数量。对需调查疫情发生情况的小班进行取样时，总数10株以下的要全部取样；总数10株以上的先抽取10株进行取样检测，如没有检测到松材线虫，应当继续取样检测，直至全部取样检测为止。

5.样品的保存与处理。采集的样品应当及时分离鉴定，样品分离鉴定后须及时销毁。样品若需短期保存，可将样品装入塑料袋内，扎紧袋口，在袋上扎若干小孔（若为木段或者圆盘无需装入塑料袋），放入4℃冰箱。若需较长时间保存，要定期在样品上喷水保湿，保存时间不宜超过1个月。

（四）分离鉴定。

1.分离。采用贝尔曼漏斗法或者浅盘法分离松材线虫，分离时间一般需12小时以上。将分离液体收集到试管或者烧杯中，通过自然沉淀或者使用离心机处理后进行鉴定。

2.鉴定。

（1）常规显微镜形态鉴定。仅适用于雌雄成虫，以雌成虫为主。将制作好的玻片置于显微镜下观察其形态，判别是否为松材线虫。若分离的线虫为幼虫，需培养至成虫后进行鉴定。

（2）分子检测（适用于各虫态）。采用PCR检测技术判别是否为松材线虫。

松材线虫分离、培养、检测鉴定的具体方法可参照国家标准《松材线虫病检疫技术规程（GB/T 23476）》进行。

其中，PCR检测技术通常是通过松材线虫自动化分子检测系统来完成的，这是能准确无误测出松材线虫的一种方法。