荧光pcr检测方法

㈠ 荧光PCR法与PCR荧光探针法有何不同

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链，它都掺。

而探针法是当探针结合到目标序列上以后，聚合酶降解探针后，探针上自带的荧光基团离开淬灭基团，从而发出荧光。

从两者的原理上来看，不难判断，荧光PCR法更加简单方便，而且成本低。而探针法特异性更强。

(1)荧光pcr检测方法扩展阅读：

荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR)。

1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

㈡ 什么是实时荧光定量PCR，检测指标是什么

实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

检测指标是：各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

原理：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

㈢ 请问荧光定量pcr是一个检测仪器的名称还是检测方法

PCR是一种检测方法，因此法是一种基因扩增法，实验室条件要求很高，临床使用实验室达不到要求，造成假阳性很多，特别是在性病门诊的使用，所以卫生部已下文停用，只用于科研。
检测性病，有用棉拭子采样的方法，检测一般是显微镜检和培养法，如淋病等。还有就是采血检测抗体的方法，如梅毒、艾滋病。

㈣ 荧光检测方法

荧光检测是一种自然发光反应，通过荧光素酶与 ATP进行反应，可检测人体细胞、细菌、霉菌、食物残渣，在15秒钟内得到反应结果。光照度通过专用设备进行测量，并以数字形式予以表示，在1975年首先被应用到食品工业中，在1985年在化妆品制造业中得到应用。
荧光定量：采用国际主流的荧光定量PCR技术，迅速提升技术水平。
结果稳定：检测结果CV值与进口全自动PCR仪接近，具有自检功能，避免错误数据的输出。
封闭操作：全部检测过程均为闭管操作，于反应管处检测荧光，有效防止污染，解决PCR技术中最棘手之难题。
准确定量：满足临床对量化的需求，定量荡围宽，可涵盖大部分病原微生物，自动曲线拟合。
灵敏度高：利用光谱信号灵敏性的优势，有效提高检测灵敏度。
安全：全程无毒检测。
操作简便：省去后处理的烦琐过程。
直接打印：直接打印结果，无须记录大量数据。
升级版：FS1000有与电脑连接的数传输口，可以连接电脑，根据用户需要提供先进分析软件，全面分析实验数据。（电脑和打印机选配件）
故障率低：维护非常简单。
节约资源：可利用现用PCR扩增仪，最大限度节约资源。

㈤ 如何用荧光PCR做定性检测实验

就直接把荧光定量PCR仪当定性PCR仪用就行了呀，只是不要定量PCR结果而已

㈥ PCR产物的检测方法有哪些

PCR产物的检测方法：

1. 琼脂糖凝胶电泳

   这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。

   用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

   （1）制胶

   琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。

   （2）加样和电泳

   上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。

   （3）检测

   将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

   聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

   聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：

   (1)制胶
   

   在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。

   制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。

   不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：

   
   

   

   
   

   在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。

   （2）加样和电泳

   上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNAMarker。

   以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。

   （3）银染

   分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。

㈦ 荧光定量PCR检测

如果临床症状已经没有了
微生物死了 它的DNA只是会延迟一段时间消失
不表示它会一直存在着
药物治疗后一两个星期用PCR法测
应该就测不出阳性了
说明完全好了

不过PCR法在这个领域唯一的优点就是快速
不太适合跟踪监测治疗效果
你可以考虑用微生物培养法
不过要去好的医院

具体情况可以向医生咨询
要相信大多数医生还是有医德的

还不给我分数吗？

㈧ 乙型肝炎病毒DNA荧光PCR定量检测

Ct值是荧光定量PCR的一个指标，代表达到设定阈值所需要的循环数。一般Ct值越小定量值越高。通俗地将，这个检测结果的意义是：通过荧光定量PCR的方法检测血液中乙肝病毒DNA的量。仪器测得Ct值为18.20,根据Ct值与定量DNA之间的换算公式，计算出每毫升血中含有82450000（八千多万）个乙肝病毒DNA分子。也就是说每毫升血液中有八千多万个乙肝病毒。

㈨ RT-PCR检测方法的具体步骤

RT-PCR检测方法的具体步骤如下：

（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计： 检测标本RNA
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。） 阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液） 1）按下表加入试剂： PCR反应体系
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增。

4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。 4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。 5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断。