电泳技术性质检测方法

A. 常用的蛋白质电泳方法有哪些

聚丙烯酰胺凝胶电泳:这是一种活性电泳，可以分析混合样品，并且可用特异检测手段检测目标物条带。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:最常用的变性电泳，可以用来测定蛋白质分子量。比层析法测定要好。

B. 电泳的结果检测

对于不同的目的，应采用不同的检测方法。用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法.
（七）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策
1．指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象。向上的“微笑”现象说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致。这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生。向下的“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。
2．“拖尾”现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的，克服的办法是在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液，加增溶辅助试剂。另一方法是降低凝胶浓度。
3．“纹理”现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的，克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒。
4．蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的，或由于加样位置偏斜而引起。
5．蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连，这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的。
6．蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的。虽然梯度凝胶可以提高分辨率，但与其他方法相比，常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法。为了提高分辨率，不要加过多的样品，小体积样品可给出窄带。加样后应立即电泳，以防止扩散。选择合适的凝胶浓度，使组分得以充分的分离。通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳，所以应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制足够长度的凝胶，以使样品不会走出前沿。样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低。水解作用通常发生在样品准备的时候，系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白，如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生。

C. 电泳法简介

目录

• 1 拼音
• 2 英文参考
• 3 纸电泳法
• 4 醋酸纤维素薄膜电泳法
• 5 叁、琼脂锋猜糖凝胶电泳法
• 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
• 7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

1 拼音

diàn yǒng fǎ

2 英文参考

electrophoresis

电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。

各电泳法，除另有规定外，照下述方法操作。

3 一、纸电泳法

1.仪器装置

包括电泳室及直流电源两部分。

常用的水平式电泳室装置如图，包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板C分成两部分；外格装有铂电极(直径0.5～0.8cm)D；里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F，此架可从槽中取出；两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。

电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般在500～10 000V。

2. 操作法

(1) 电泳缓冲液

枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)

取枸橼酸 (C6H8O7·H2O)39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。

(2) 滤纸

取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端5～8cm处划一起始线，每隔2.5～3cm处做一记号备点样用。

(3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10μl,共3点，并留2个空白位置。

干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点完规定段冲量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。

(4) 电泳

于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为18～20V/cm，电泳约1小时45分握基歼钟，取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。

(5) 含量测定

剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。

4 二、醋酸纤维素薄膜电泳法

1.仪器装置

电泳室及直流电源同纸电泳。

2.试剂

(1) 巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。

(2) 氨基黑染色液

取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(3) 漂洗液

取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。

(4) 透明液

取冰醋酸25ml，加无水乙醇75ml，混匀。

3.操作法

(1) 醋酸纤维素薄膜

取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。

(2) 点样与电泳

于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5％的供试品溶液2～3μl,在10～12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4～5cm为宜。

(3) 染色

电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。

(4) 透明

将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10～15分钟，取出平铺于洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长期保存。

(5) 含量测定

未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。

洗脱法

将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6％的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全， 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占百分率。

扫描法

将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 （未透明薄膜） 或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸收度，计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。

5 叁、琼脂糖凝胶电泳法

1.仪器装置

电泳室及直流电源同纸电泳。

2.试剂

(1) 醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)

取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。

(2) 甲苯胺蓝溶液

取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。

3.操作法

(1)制胶

取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。

(2) 标准品溶液及供试品溶液的制备

照各药品项下规定配制。

(3) 点样与电泳

在电泳槽内加入醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm，电流强度1～2mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。

(4) 染色与脱色

取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。

6 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

1.仪器装置

通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。

2.试剂

(1)溶液A

取叁羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。

(2)溶液B

取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。

(3)电极缓冲液(pH8.3)

取叁羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。

(4)溴酚蓝指示液

取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。

(5)染色液

取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)叁氯醋酸溶液至10ml。

(6)稀染色液

取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)叁氯醋酸溶液至10ml。

(7)脱色液

7％醋酸溶液。

3.操作法

(1)制胶

取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡， 加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。

(2)标准品溶液及供试品溶液的制备

照各药品项下的规定。

(3)电泳

将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。

(4)染色和脱色

电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10～30分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。

(5)结果判断

将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。

相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R''<[m]>)进行比较。其计算式如下：

进胶端到供试品或标准品区带的距离

相对迁移率(R''<[m]>)＝─────────────────

进胶端到溴酚蓝区带的距离

扫描

将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分，由各组分的峰面积计算百分含量。

7 五、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R''<[m]>)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。

1.仪器装置

除另有规定外，同聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2.试剂

(1)丙烯酰胺液溶

称取丙烯酰胺22.2g与双丙烯酰胺0.6g， 溶于100ml水中，贮于褐色瓶中低温保存。

(2) 凝胶缓冲液

称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、磷酸氢二钠(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g与十二烷基硫酸钠2.0g，加水至1000ml(若有沉淀析出,可加温至37℃溶解)。

(3)电泳缓冲液

将凝胶缓冲液稀释1倍。

(4)染色液

称取25mg考马斯亮蓝R<[250]>,溶于57％乙醇与9.2％醋酸混合液100ml中。

(5)脱色液

取无水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀释至1000ml。

3.操作法

除下列规定外，其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(1)制胶

用丙烯酰胺溶液－凝胶缓冲液－水－1.6％过硫酸铵溶液四甲基乙二胺(需冷却)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。

(2)标准蛋白溶液及供试品溶液的制备

取标准蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制。

(3)电泳

调节电流使每管为8mA。

4.相对迁移率和分子量计算

将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移率：

蛋白移动的距离染色前的胶条长度

相对迁移率(R''<[m]>)＝──────────×──────────

脱色后的胶条长度染料移动的前沿距离

D. 常见的电泳方法

实验室中常见的电泳方法有以下几种：
一、纸电泳
指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。
将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V～1000V）进行电泳。
二、醋酸纤维素薄膜电泳
电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
三、凝胶电泳
由区带电泳中派生出的一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式。
凝胶电泳中的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是普通电泳中应用最多的两种形式。
目前，这种办法被广泛用来分析蛋白质和核酸。
四、等电聚焦电泳
1．等电聚焦电泳过程
一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液（两性载体电解质）中进行分离，每一种被分离的两性物质都移向与它的等电点相一致的pH位置，在那里不再移动（称为聚焦）。
2．等电聚焦电泳的特点
使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；
由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；
电泳速度快;分辨率高;
加入样品的位置可任意选择；
可用于测定蛋白质类物质的等电点;
适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。
五、等速电泳
采用两种不同浓度的电解质，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，尾随电解质则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离。
六、双向凝胶电泳（二维电泳）
第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。
第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。
七、免疫电泳
免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开；然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。