① 科普讲堂|实时荧光定量PCR检测方法
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。目前，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。该项技术可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析，提高了普通PCR技术的特异性和准确性，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。
一、常规PCR
利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA分子扩增的目的，常规PCR技术无法实现精确定量。
二、实时荧光定量PCR
如要对DNA、RNA样品进行精确定量研究，就需要采用实时荧光定量PCR，根据检测实时荧光PCR产物的方式不同，实时荧光定量PCR主要有DNA结合染料法、基于探针的化学法、淬灭染料引物法等类型。
1. DNA 结合染料法
原理 ：应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。
应用于核算定量和基因表达验证。
优缺点： 它们的优点是可以对任何双链DNA 进行定量，不需要探针，具有相对高的灵敏度和可靠性，并且成本低，简单易用，缺点是它们能在反应中结合所有的DNA双链，其中包括在PCR过程中产生的引物二聚体或其他非特异产物。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，不会与单链DNA结合，并且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。
2. 基于探针的化学法
原理： 应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递检测特异性扩增产物。
应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR。
优缺点： 探针法的鉴别能力远远大于DNA结合染料法，因为它们只与目的产物结合，从不与引物二聚体或其他非特异产物结合，缺点是它的合成价格高。
探针法中最常用的TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，PCR扩增时在加入引物的同时加入探针，探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而检测器可以接收到荧光信号。
3. 淬灭染料引物法
原理： 采用荧光标记引物扩增，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中，依赖荧光能量共振传递。
应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR
优缺点：探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性，还可进行多重PCR扩增，缺点是原料成本价格高
三、实时荧光PCR仪
实时荧光PCR系统包括热循环仪，用于荧光激发的光学系统以及用于收集荧光数据和管理分析的计算机软件，数据通过实时分析软件以图表的形式显示。
② 小目标检测相关技巧总结
小目标问题在物体检测和语义分割等视觉任务中一直是存在的一个难点，小目标的检测精度通常只有大目标的一半。
CVPR2019论文: Augmentation for small object detection 提到了一些应对小目标检测的方法，笔者结合这篇论文以及查阅其它资料，对小目标检测相关技巧在本文进行了部分总结。
小目标的定义： 在MS COCO数据集中，面积小于 32*32 的物体被认为是小物体。
小目标难以检测的原因： 分辨率低，图像模糊，携带的信息少。由此所导致特征表达能力弱，也就是在提取特征的过程中，能提取到的特征非常少，这不利于我们对小目标的检测。
1、由于小目标面积太小，可以放大图片后再做检测，也就是在尺度上做文章，如FPN（Feature Pyramid Networks for Object Detection），SNIP（An Analysis of Scale Invariance in Object Detection – SNIP)。
Feature-Fused SSD: Fast Detection for Small Objects, Detecting Small Objects Using a Channel-Aware Deconvolutional Network 也是在多尺度上做文章的论文。
2、在Anchor上做文章(Faster Rcnn，SSD, FPN都有各自的anchor设计)，anchor在设置方面需要考虑三个因素：
anchor的密度： 由检测所用feature map的stride决定，这个值与前景阈值密切相关。
anchor的范围： RetinaNet中是anchor范围是32~512，这里应根据任务检测目标的范围确定，按需调整anchor范围，或目标变化范围太大如MS COCO，这时候应采用多尺度测试。
anchor的形状数量： RetinaNet每个位置预测三尺度三比例共9个形状的anchor，这样可以增加anchor的密度，但stride决定这些形状都是同样的滑窗步进，需考虑步进会不会太大，如RetinaNet框架前景阈值是0.5时，一般anchor大小是stride的4倍左右。
该部分anchor内容参考于: https://zhuanlan.hu.com/p/55824651
3、在ROI Pooling上做文章，文章SINet: A Scale-Insensitive Convolutional Neural Network for Fast Vehicle Detection 认为小目标在pooling之后会导致物体结构失真，于是提出了新的Context-Aware RoI Pooling方法。
4、用生成对抗网络(GAN)来做小目标检测：Perceptual Generative Adversarial Networks for Small Object Detection。
1、从COCO上的统计图可以发现，小目标的个数多，占到了41.43%，但是含有小目标的图片只有51.82%，大目标所占比例为24.24%，但是含有大目标的图像却有82.28%。这说明有一半的图像是不含小目标的，大部分的小目标都集中在一些少量的图片中。这就导致在训练的过程中，模型有一半的时间是学习不到小目标的特性的。
此外，对于小目标，平均能够匹配的anchor数量为1个，平均最大的IoU为0.29，这说明很多情况下，有些小目标是没有对应的anchor或者对应的anchor非常少的，即使有对应的anchor，他们的IoU也比较小，平均最大的IoU也才0.29。
如上图，左上角是一个anchor示意图，右上角是一个小目标所对应的anchor，一共有只有三个anchor能够与小目标配对，且配对的IoU也不高。左下角是一个大目标对应的anchor，可以发现有非常多的anchor能够与其匹配。匹配的anchor数量越多，则此目标被检出的概率也就越大。
实现方法：
1、Oversampling ：我们通过在训练期间对这些图像进行过采样来解决包含小对象的相对较少图像的问题（多用这类图片）。在实验中，我们改变了过采样率和研究不仅对小物体检测而且对检测中大物体的过采样效果
2、Copy-Pasting Strategies：将小物体在图片中复制多分，在保证不影响其他物体的基础上，增加小物体在图片中出现的次数（把小目标扣下来贴到原图中去），提升被anchor包含的概率。
如上图右下角，本来只有一个小目标，对应的anchor数量为3个，现在将其复制三份，则在图中就出现了四个小目标，对应的anchor数量也就变成了12个，大大增加了这个小目标被检出的概率。从而让模型在训练的过程中，也能够有机会得到更多的小目标训练样本。
具体的实现方式如下图：图中网球和飞碟都是小物体，本来图中只有一个网球，一个飞碟，通过人工复制的方式，在图像中复制多份。同时要保证复制后的小物体不能够覆盖该原来存在的目标。
网上有人说可以试一下lucid data dreaming Lucid Data Dreaming for Multiple Object Tracking ，这是一种在视频跟踪/分割里面比较有效的数据增强手段，据说对于小目标物体检测也很有效。
基于无人机拍摄图片的检测目前也是个热门研究点（难点是目标小，密度大）。
相关论文：
The Unmanned Aerial Vehicle Benchmark: Object Detection and Tracking（数据集）
Drone-based Object Counting by Spatially Regularized Regional Proposal Network
Simultaneously Detecting and Counting Dense Vehicles from Drone Images
Vision Meets Drones: A Challenge（数据集）
1: https://zhuanlan.hu.com/p/55824651
2: https://zhuanlan.hu.com/p/57760020
3: https://www.hu.com/question/269877902/answer/548594081
4: https://zhuanlan.hu.com/p/60033229
5: https://arxiv.org/abs/1902.07296
6: http://openaccess.thecvf.com/content_cvpr_2017/papers/Li_Perceptual_Generative_Adversarial_CVPR_2017_paper.pdf
7: http://openaccess.thecvf.com/content_cvpr_2017/papers/Lin_Feature_Pyramid_Networks_CVPR_2017_paper.pdf
③ 计算机视觉——典型的目标检测算法(OverFeat算法)（二）
【嵌牛导读】目标检测在现实中的应用很广泛，我们需要检测数字图像中的物体位置以及类别，它需要我们构建一个模型，模型的输入一张图片，模型的输出需要圈出图片中所有物体的位置以及物体所属的类别。在深度学习浪潮到来之前，目标检测精度的进步十分缓慢，靠传统依靠手工特征的方法来提高精度已是相当困难的事。而ImageNet分类大赛出现的卷积神经网络（CNN）——AlexNet所展现的强大性能，吸引着学者们将CNN迁移到了其他的任务，这也包括着目标检测任务，近年来，出现了很多目标检测算法。
【嵌牛鼻子】计算机视觉
【嵌牛提问】如何理解目标检测算法——OverFeat
【嵌牛正文】
一、深度学习的典型目标检测算法
深度学习目标检测算法主要分为 双阶段检测算法 和 单阶段检测算法 ，如图1所示。
双阶段目标检测算法先对图像提取候选框，然后基于候选区域做二次修正得到检测结果，检测精度较高，但检测速度较慢;单阶段目标验测算法直接对图像进行计算生成检测结果，检测速度快,但检测精度低。
1、双阶段目标检测算法
双阶段目标检测方法主要通过选择性搜索（Selective Search）或者Edge Boxes等算法对输入图像选取可能包含检测目标的候选区域（Region Proposal），再对候选区域进行分类和位置回归以得到检测结果。
1.1 OverFeat 算法
《OverFeat: Integrated Recognition, Localization and Detection using Convolutional Networks》
Sermanet 等改进AlexNet 提出 OverFeat 算法。该算法结合AlexNet通过多尺度滑动窗口实现特征提取功能，并且共享特征提取层，应用于图像分类、定位和目标检测等任务。
关键技术：
1、FCN（ 全卷积神经网络 ）
对于一个各层参数结构都设计好的网络模型，要求输入图片的尺寸是固定的（例如，Alexnet要求输入图片的尺寸为227px*227px）。如果输入一张500*500的图片，希望模型仍然可以一直前向传导，即一个已经设计完毕的网络，可以输入任意大小的图片，这就是FCN。
FCN的思想在于：
1、从卷积层到全连接层，看成是对一整张图片的卷积层运算。
2、从全连接层到全连接层，看成是采用1*1大小的卷积核，进行卷积层运算。
如上图所示，绿色部分代表卷积核大小。假设一个CNN模型，其输入图片大小是14*14，通过第一层卷积后得到10*10大小的图片，然后接着通过池化得到了5*5大小的图片。像但是对于像素值为5*5的图片到像素值为1*1的图片的过程中：
（1）传统的CNN：如果从以前的角度进行理解的话，那么这个过程就是全连接层，我们会把这个5*5大小的图片，展平成为一维向量进行计算。
（2）FCN：FCN并不是把5*5的图片展平成一维向量再进行计算，而是直接采用5*5的卷积核，对一整张图片进行卷积运算。
二者本质上是相同的，只是角度不同，FCN把这个过程当成了对一整张特征图进行卷积，同样，后面的全连接层也是把它当做是以1*1大小的卷积核进行卷积运算。
当输入一张任意大小的图片，就需要利用以上所述的网络，例如输入一张像素为16*16的图片：
根据上图，该网络最后的输出是一张2*2的图片。可见采用FCN网络可以输入任意大小的图片。同时需要注意的是网络最后输出的图片大小不在是一个1*1大小的图片，而是一个与输入图片大小息息相关的一张图片。
Overfeat就是把采用FCN的思想把全连接层看成了卷积层，在网络测试阶段可以输入任意大小的图片。
2、offset max-pooling
简单起见，不用二维的图像作为例子，而是采用一维作为示例：
如上图所示，在X轴上有20个神经元，并且选择池化size=3的非重叠池化，那么根据之前所学的方法应该是：对上面的20个神经元，从1位置开始进行分组，每3个连续的神经元为一组，然后计算每组的最大值(最大池化)，19、20号神经元将被丢弃，如下图所示：
或者可以在20号神经元后面，添加一个数值为0的神经元编号21，与19、20成为一组，这样可以分成7组:[1,2,3]，[4,5,6]……,
[16,17,18],[19,20,21]，最后计算每组的最大值。
如果只分6组，除了以1作为初始位置进行连续组合之外，也可以从位置2或者3开始进行组合。也就是说其实有3种池化组合方法：
A、△=0分组:[1,2,3]，[4,5,6]……,[16,17,18]；
B、△=1分组:[2,3,4]，[5,6,7]……,[17,18,19]；
C、△=2分组:[3,4,5]，[6,7,8]……,[18,19,20]；
对应图片如下：
以往的CNN中，一般只用△=0的情况，得到池化结果后，就送入了下一层。但是该文献的方法是，把上面的△=0、△=1、△=2的三种组合方式的池化结果，分别送入网络的下一层。这样的话，网络在最后输出的时候，就会出现3种预测结果了。
前面所述是一维的情况，如果是2维图片的话，那么(△x,△y)就会有9种取值情况(3*3)；如果我们在做图片分类的时候，在网络的某一个池化层加入了这种offset 池化方法，然后把这9种池化结果，分别送入后面的网络层，最后的图片分类输出结果就可以得到9个预测结果(每个类别都可以得到9种概率值，然后我们对每个类别的9种概率，取其最大值，做为此类别的预测概率值)。
算法原理：
文献中的算法，就是把这两种思想结合起来，形成了文献最后测试阶段的算法。
1、论文的网络架构与训练阶段
(1)网络架构
对于网络的结构，文献给出了两个版本——快速版、精确版，一个精度比较高但速度慢；另外一个精度虽然低但是速度快。下面是高精度版本的网络结构表相关参数：
表格参数说明：
网络输入：图片大小为221px*221px；
网络结构方面基本上和AlexNet相同，使用了ReLU激活，最大池化。不同之处在于：(a)作者没有使用局部响应归一化层；(b)然后也没有采用重叠池化的方法；(c)在第一层卷积层，stride作者是选择了2，这个与AlexNet不同（AlexNet选择的跨步是4，在网络中，如果stride选择比较大得话，虽然可以减少网络层数，提高速度，但是却会降低精度）。
需要注意的是把f7这一层，看成是卷积核大小为5*5的卷积层，总之就是需要把网络看成前面所述的FCN模型，去除了全连接层的概念，因为在测试阶段可不是仅仅输入221*221这样大小的图片，在测试阶段要输入各种大小的图片，具体请看后面测试阶段的讲解。
(2)网络训练
训练输入：对于每张原图片为256*256，然后进行随机裁剪为221*221的大小作为CNN输入，进行训练。
优化求解参数设置：训练的min-batchs选择128，权重初始化选择高斯分布的随机初始化：
然后采用随机梯度下降法，进行优化更新，动量项参数大小选择0.6，L2权重衰减系数大小选择10-5次方。学习率初始化值为0.05，根据迭代次数的增加，每隔几十次的迭代后，就把学习率的大小减小一半。
然后就是DropOut，这个只有在最后的两个全连接层，才采用dropout，dropout比率选择0.5。
2、网络测试阶段
在Alexnet的文献中，预测方法是输入一张图片256*256，然后进行multi-view裁剪，也就是从图片的四个角进行裁剪，还有就是一图片的中心进行裁剪，这样可以裁剪到5张224*224的图片。然后把原图片水平翻转一下，再用同样的方式进行裁剪，又可以裁剪到5张图片。把这10张图片作为输入，分别进行预测分类，在后在softmax的最后一层，求取个各类的总概率，求取平均值。
然而Alexnet这种预测方法存在两个问题：
一方面这样的裁剪方式，把图片的很多区域都给忽略了，这样的裁剪方式，刚好把图片物体的一部分给裁剪掉了；
另一方面，裁剪窗口重叠存在很多冗余的计算，像上面要分别把10张图片送入网络，可见测试阶段的计算量还是较大的。
Overfeat算法：
训练完上面所说的网络之后，在测试阶段不再是用一张221*221大小的图片了作为网络的输入，而是用了6张大小都不相同的图片，也就是所谓的多尺度输入预测，如下表格所示：
当网络前向传导到layer 5的时候，就利用了前面所述的FCN、offset pooling这两种思想的相结合。现以输入一张图片为例(6张图片的计算方法都相同)，讲解layer 5后面的整体过程，具体流程示意图如下：
步骤一：
对于某个尺度的图片，经过前五层的卷积后得到特征图。上图中特征图的分辨率是20x23，256个通道。
步骤二：
对于该特征图，重复多次使用非重叠的池化，每次池化的偏置不同，有行偏置和列偏置。上图中偏置池化3次，偏置分别为为(0,1,2)。这就是offset pooling，也被称为fine stride。offset pooling得到的特征图的维度为6x7x3x3xD，其中6x7是特征图的分辨率，3x3是偏置池化的次数，D是通道数。上图中是以1维显示的。
步骤三：
池化后得到的特征图将被送入分类器。
步骤四：
分类器的输入是的5x5xD，输出是C(类别数)维向量。但是offset pooling后得到的特征图并不是5x5xD，比如上图中的特征图大小为6x7xD，因此分类器以滑动窗口的方式应用在特征图上，每个滑动窗口经过分类器输出一个C维向量。比如上图中输入的6x7xD的特征图最终得到2x3xC的输出，其中2x3是滑动窗口的个数。
步骤五：
而2x3xC只是一组偏置池化的输出，总的输出为2x3x3x3xC，将输出的张量reshape，得到6x9xC输出张量。最终输出分类张量为3d张量，即两个分辨率维度 x C维。
然后需要在后面把它们拉成一维向量，这样在一个尺度上，可以得到一个C*N个预测值矩阵，每一列就表示图片属于某一类别的概率值，并且求取每一列的最大值，作为本尺度的每个类别的概率值。
最后一共用了6种不同尺度(文献使用了12张，另外6张是水平翻转的图片)进行做预测，然后把这六种尺度结果再做一个平均，作为最最后的结果。
从上面过程可以看到整个网络分成两部分：layer 1~5这五层称之为特征提取层；layer 6~output称之为分类层。
六、定位任务
用于定位任务的时候，就把分类层(上面的layer 6~output)给重新设计一下，把分类改成回归问题，然后在各种不同尺度上训练预测物体的bounding box。