园艺植物病毒检测的方法

⑴ 常用的植物病毒分子检测诊断技术有哪些

1 RT-PCR技术

RT-PCR是英文Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction的简写，中文称之为反转录聚合酶链式扩增反应。在反转录酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA为模板、以20个左右的核苷酸为引物，反转录合成cDNA。再以cDNA为模板，两个3和5端互补寡核苷酸引物，由Taq聚合酶从5→3进行一系列DNA聚合反应，扩增出所需要的目的DNA，可将极微量的靶DNA特异性地扩增上百万倍，从而大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。

利用PCR技术，可以检测到单分子核酸或对每10万个细胞中仅含1个靶核酸分子的样品。因此，该技术创立至今十年来，迅速地形成为常规的标准程序，为生物科学提供了从微量微生物材料中快速得到大量特定的遗传物质的实验手段。PCR在植物病毒的检测、鉴定和植物病毒的检疫工作中也将具有重要意义。如果病毒核酸是DNA类型，不需要反转录（RT），直接可以进行聚合酶链式扩增（PCR）。而大多数植物病毒的核酸类型为RNA，因此，需要先进行反转录（RT），再进聚合酶链式（PCR）扩增。用1%琼脂糖和5%聚丙烯酰胺进行电泳，即可检出扩增片段。

这里以香石竹斑驳病毒为例，介绍RT-PCR检测香石竹斑驳病毒的实验技术。

用已知病毒核酸保守序列设计引物，分别提取病、健植物总RNA为模板，进行RT-PCR反应，琼脂糖或PAGE电泳检测扩增结果。感病材料会出现特异扩增带。如香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus，CarMV）。根据该病毒的RNA序列设计引物，P1引物（5′端引物，与CarMV RNA的2516～2538同源）：5′-〔TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC〕-3′。P2引物（3′端互补引物，与CarMV RNA的3100～3124对应）：5′-〔AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，GAG〕-3′。目标片段大小为608nt。对病健材料进行了RT-PCR，从感病材料中可以扩增出了大约600bp的特异片段，而健康植物无此扩增带。用此方法可以快速、准确地检测香石竹斑驳病毒。操作如下：

（1）RNA提取

分别取感病及健康叶片0.2～0.5g，加液氮研成粉末，按1g∶2ml的比例悬浮于RNA抽提缓冲液（20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巯基乙醇）。按1∶1比例加入水饱和苯酸—氯仿—异戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提数次，乙醇沉淀总RNA。溶入20～50μl TE缓冲液中，-70℃冰箱保存备用。

（2）cDNA合成反应体系组分为

待检测材料总RNA或健康材料总RNA各0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV缓冲液4μl，ddH2O7μl，该混合液于88℃处理10min后冰上迅速冷却，然后加入10mmol/L dNTPs 1μl，40U/μl Rnasin 0.5μl，100mmol/L DTT 2μl，200U/μl MMLV逆转录酶1μl，混合后经42℃处理lh，合成cDNA。

（3）PCR扩增

取上述的cDNA各0.5μg，分别加入10×PCR缓冲液5μl，20pmol/L引物P1和引物P2各1μl，10mmol/LdNTPs 1μl，88℃10min之内加2U/μl Taq DNA聚合酶1μl，加ddH2O至50/μl。然后在液面上加三滴石蜡油，进行如下PCR热循环：94℃3min，60℃1min，72℃1min，1次循环；94℃40s、60℃1min，72℃1min，35次循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检查。携带CarMV的样品会出现600bp的特性扩增带。如图1。

图1 CarMV PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

⑵ 植物病毒检测的血清学技术都有哪些

植物病毒的外壳是一种核蛋白，在蛋白的表面带有抗原决定簇，当植物病毒进入动物体内时，即可产生与抗原相应的抗体，这种带有抗体的血清即为抗血清。相应的抗原抗体之间可产生专化性的结合，即抗体只能与其相应的抗原结合并产生一定的反应，此即血清反应。这种反应在植物体外也能进行，根据这种反应可以测定两种病毒间的关系。因而，血清学检测成为植物病毒的重要鉴定技术。常见的血清反应主要有以下几种：

中和反应：使含有植物病毒的汁液与相应抗血清中的抗体充分结合，当抗体过量时，可将所有植物病毒抗原全部吸收掉，此时因植物病毒汁液中已没有病毒粒子存在而失去侵染性。此即为中和反应，不仅可对植物病毒进行定性，还可用于定量测定。

沉淀反应：将一系列稀释度的抗原（病毒）和一系列稀释的抗体（抗血清）分别混合，在两者稀释比例适宜范围内可出现沉淀物，此即为沉淀反应。此类反应如：微量沉淀反应，琼脂双扩散反应，及免疫电泳等，都是在植物病毒检验中最常见的血清学技术。

凝集反应：把病毒的抗体先吸于一种与免疫无关的颗粒表面，然后使其与相应的抗原结合而出现的凝集，即为凝集反应。常用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、炭末、血细胞、A蛋白等。

抗体标记：对抗体用荧光素、酶或同位素等进行标记，然后通过对标记物的检测追踪抗原，常用的有酶联免疫吸附、荧光免疫、同位素免疫实验等，这类检测技术灵敏度极高，适于对微量抗原的检测。

现将在植物检疫中常用的几种血清学技术介绍于下。

1.微量沉淀反应

在溶有抗原的溶液内按适当比例加入抗血清时，抗原与抗体互相结合而沉淀。其方法如下：

（1）用蜡笔在培养皿底部各划8条横竖线形成方格。

（2）取两排小试验管，每排7～8个，一排用于抗原，一排用于抗血清，每试管中加0.2ml的缓冲液。

（3）制备1mg/ml纯化病毒原液，在抗原稀释排中加0.2ml原液于第一试管，用1ml的移液管再从中吸0.2ml移至第二管，然后再移0.2ml于第三管，一直移到最后一管，各管的稀释度分别为原液的1/2至1/128。

（4）在小试管中加1.5ml含0.025%防腐剂NaN3的缓冲液，在缓冲液内混入0.1ml未稀释的抗血清，制备出1/16稀释度的抗血清作为原液；在第二排的第一试管中加0.2ml的原液，混合后移0.2ml至第二管，如此一直到最后一管，制备出1/32～1/2048的稀释系列的抗血清。

（5）用微量移液管从抗血清最高稀释度（1/2048）开始，在培养皿的第七横排的每个方格滴加1滴，同样将1/1024稀释度的抗血清加到第六横排，这样将板上所有的方格均滴加各种稀释度的抗血清。

（6）用另一移液管从最稀的抗原液开始，在第七纵排每方格内滴加1滴，按同样方法在第一至第七纵排各方格内滴加各种稀释度的抗原。在所有第八横排和纵排的方格内滴一滴缓冲液做对照。随后在反应液滴上复盖一层液体石蜡油防止蒸发。

（7）将制备好的培养皿在室温湿润环境下孵育2h后，在暗室用双目解剖镜观察，然后在普通冰箱内过夜，第二天继续观察结果，此时沉淀已清晰可见。

以最浓的沉淀为四，以下逐渐减弱的梯度分别记为三、二、一，以三为抗原最大稀释度和产生沉淀的最小血清用量，作为抗原抗体最适比例

微量沉淀技术测定抗原抗体最适反应浓度表

（8）实际测定时，用最适稀释度的抗血清与其相应的抗原和异种抗原进行反应，或用最适稀释度的抗原与其相应的抗血清和异种抗血清进行反应，均可观察它们间的血清学关系。如表0-4-2所示，

微量沉淀技术测定多种抗原间血清学关系表

各供试抗原的稀释度为1.56mg/ml，与1/4至1/1024的不同稀释度的抗血清反应结果表明，第一、二、五、六、七横排的抗原与抗血清的相应抗原是相同的，第三、四两排抗原与抗血清的相应抗原虽然不同，但有一定亲缘关系，第八、十排抗原则与抗血清的相应抗原有远缘关系或无血清学关系，第九排的抗原则完全无关。

2.琼脂双扩散试验

琼脂凝胶的含水量极高，允许分子质量20万u以下的大分子物质自由通过，绝大多数的抗原和抗体分子质量都在20万u以下，在琼脂凝胶中的运动所受阻力甚小，可自由扩散，免疫双扩散就是应用这一原理，在一块琼脂凝胶板上打几个小孔，分别置入抗原及其相应抗体，抗原与抗体分别向凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度最适比例处，形成肉眼可见的抗原抗体结合物的沉淀带，带的大小形状数量和密度决定于所测试的抗原抗体的特性。本法适于检测植物粗汁液、澄清液和高度纯化的抗原。试验时需设置健康植物汁液及标准抗原作为阴性和阳性对照。本法的特点是可同时检测一种抗原对多种抗体，或一种抗体对多种抗原间的血清学关系，对病毒的鉴别极为方便。缺点是灵敏度较低，抗血清用量大，检测时间长。具体检测技术如下：

（1）称取琼脂加入适当的缓冲液中，用水浴或微波炉加热至琼脂溶解，按0.1%加叠氮化钠。置培养皿或玻璃平板于水平台面，当琼脂冷却至60℃时，倒适当量于板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。静置至凝固。

（2）将模式图置于板下，用打孔器打孔，挑除孔中琼脂，孔的排列有多种形式，常用的排列，由一个中央孔和周围六个孔组成，孔的直径7mm，周围孔与中央孔的距离为3～4mm。

（3）用缓冲液或生理食盐水在小试管中稀释抗原，在周围孔中加最适稀释度的抗原，在中央孔中加最适稀释度的抗血清。外围孔中加倍比稀释系列的抗原，中央孔加倍比稀释系列的抗血清，产生致密狭窄的沉淀线的组合为最适浓度。

（4）将培养皿在保湿环境下进行孵育，次日在暗背景下观察沉淀线出现情况。在印有排列模式团的纸上，图记沉淀线的形式，沉淀线图形可用照相或染色保留。

（5）结果的判断：根据沉淀线的形状分析抗原与抗体，及抗原互相间的关系。

对长形病毒进行琼脂双扩散检测时，可在琼凝胶介质中加入十二烷基磺酸钠（SDS），此剂为一种阳离子表面活性剂，可将病毒裂解成具有抗原活性的可扩散的片断利于检测。

3.对流免疫电泳

在以琼脂凝胶为介质的情况下，免疫球蛋白带有微弱负电荷不能抵消电渗作用，故在电泳时向负极迁移，而一般抗原蛋白带有较强的负电荷，抵消电渗后仍向正极迁移。依此设计的对流免疫电泳是将琼脂电泳与免疫沉淀相结合的方法，将抗原病毒放在琼脂凝胶靠近阴极一侧，抗体放在靠近阳极一侧，在直流电场中，抗原迁向正极，免疫球蛋白迁向负极，相遇后形成免疫沉淀线。具体技术如下：

（1）凝胶床的制备。取定量琼脂粉用蒸馏水浸泡2～3d，每日换水1～2次，用硼酸缓冲液配成1%～1.2%的琼脂液，加0.1%叠氮化钠。将玻璃放在水平台上用吸管将缓冲液琼脂注到板面，制成2mm厚的凝胶床并打孔。

（2）将制好的凝胶床放在电泳槽内，加缓冲液（用配制琼脂凝胶的缓冲液稀释1倍）离床面2～4cm，在琼脂板阴极一端孔中加入抗原，在靠阳极一端孔中加入特异性抗血清，在琼脂床的两端用两层纱布使琼脂板与电泳槽中的缓冲液相连，进行电泳。

（3）进行电泳时，电压、电流和时间，根据缓冲液离子强度、电泳床大小和抗原性质而有所不同。只要不使病毒抗原变性，尽量保持较高的电压，如电流超过2mA，电泳应在低温下进行。

（4）电泳完毕后，将电泳板放在黑色背景处观察，也可将电泳完毕的琼脂凝胶板先浸在生理食盐水中30min，然后放在苦味酸溶液中20min，可将背景染成黄色，沉淀为白色，便于观察。

免疫电泳与琼脂双扩散相比有三个优点，快速、灵敏并可用于在琼脂中扩散慢的长形病毒。

4.乳胶凝集试验及A蛋白乳胶凝集试验

用特异性抗血清提纯的免疫球蛋白，将其吸附在乳胶粒子上，制备抗体免疫球蛋白致敏乳胶。当与相应的抗原相遇时即可产生凝集反应。这是一种灵敏度高特异性强的血清学技术，但是每次都要特异性抗血清提取抗体γ球蛋白，制备手续繁杂不便应用，如直接用抗血清致敏乳胶则显着影响效果。其后Querfurth（1979）发现A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影响与相应抗原结合。这样就可先使A蛋白与乳胶粒子结合，再与抗血清中的免疫球蛋白结合，形成A蛋白-乳胶-免疫球蛋白的复合体。这种乳胶凝集试验可简化致敏免疫球蛋白的过程，而获得同样效果。具体做法如下。

（1）免疫球蛋白致敏乳胶的制备。

将特异抗血清用33%饱和硫酸盐析法提取球蛋白，悬浮于0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）缓冲液内，取10%空白乳胶稀释15倍后与等量适宜浓度的球蛋白液混合，置室温2h后移入冰箱内过夜。经低速离心（7000r/min，20min）取沉淀悬浮于缓冲液内，经反复离心洗涤2次后将最后沉淀物悬浮于缓冲液内即可得抗体球蛋白的致敏乳胶。

（2）A蛋白乳胶致敏抗体的制备。

将市售A蛋白溶于0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸缓冲液内，制成A蛋白溶液，与等量稀释15倍的空白乳胶液混合，置室温3h，移入冰箱过夜。低速离心（7000r/min20min）后将沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液，反复离心洗涤2次，沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液制备A蛋白乳胶溶液，与等量适宜稀释度的抗血清混合，置室温下3h后移入冰箱过夜。再反复离心洗涤2次，最后将沉淀悬浮于与抗血清等等量的甘氨酸缓冲液内，即可得A蛋白乳胶致敏抗体。

（3）检测法。

用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀释抗原，制成20、40、80、160、320、640、1280的系列浓度，在一洁净玻璃板上，用笔画好方格，每格加2滴不同稀释度的抗原，然后再加1滴乳胶致敏抗体（或A蛋白乳胶致敏抗体）用微量血液振荡器以120r/min振荡混合后，用肉眼或10～25倍解剖镜观察结果。同时设空白乳胶液和健汁液对照。

阳性反应表现有明显的絮状或颗粒状凝集物，背景清明透亮，阴性反应则仍为均匀的牛乳状液。也可用浊度计检测其凝集度。

此法受健康植株蛋白的干扰较小，适于直接采自病株的澄清液，不但适合球状病毒，对杆菌状病毒，棒状病毒，线状病毒也适用，并有较高的灵敏度。但对效价低的抗血清或含有乳状胶体的植物不适用。

5.酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原或抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助标记在抗体上的酶与底物所产生的颜色，检测相应的抗原。此法灵敏度高，特异性强，快速简便极适宜植物检疫应用。常用的检测方法有以下几种：

（1）直接法。

将待测样品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板内，保温后洗涤，使附着于壁上的抗原与加入的酶标抗体γ球蛋白反应，洗涤后保留与抗原结合的酶标γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度计进行检测。

（2）间接法。

先用抗兔球蛋白山羊抗体与酶结合制备酶标记抗体，将待检抗原包被于固相载体，经过孵育洗涤，加入特异性兔抗血清，孵育洗涤后加羊抗兔酶标记抗体，孵育洗涤后加入底物，观察结果。

（3）双抗体夹心法。

先将特异抗体免疫球蛋白包被于固相载体，保温洗涤后，加待测抗原，使与吸附于载体上的抗体反应，保温洗涤后再加入特异抗体的酶标记物，最后加底物观察反应结果。

（4）A蛋白酶联法。

将A蛋白用pH9.6的甘氨酸缓冲液稀释后包被微板，加入特异性抗血清，使其与已固定在微板上的A蛋白结合，再加入待测抗原使其与特异性抗体反应，再加入特异性抗体，使其与抗原反应，再加酶标记A蛋白，最后加酶的底物测其光密度值。

（5）异种动物双抗体夹心法。

先将第一抗体（兔血清抗体）包被微量反应板，加待测抗原后，加适宜浓度的第二抗体（鼠腹水抗体），再加入市售羊抗鼠酶标记物，最后加底物观察反应，一般8h即可得出结果。此法保持了双抗体夹心法快速准确灵敏度高的特点，对球状病毒、杆状病毒、线状病毒、棒状病毒均可应用。抗体不必纯化可直接使用（但未纯化的抗血清需先选择其最适工作浓度），使用市售酶标记物，可省去制备酶标记抗体的复杂手续，还可克服间接法非特异性反应干扰大的弱点。

（6）生物素抗生物素酶联法。

生物素具有很强的亲和力，是抗原抗体反应的1万倍，两者一旦结合就难以离解，且不受酸碱变性剂蛋白溶解酶及有机溶剂的影响，具有高度稳定性，生物素一经活化可与蛋白质呈偶联结合，即一个大分子可结合多个生物素分子，生物素又可大量结合在酶标记物上，使酶标记物成为多价，而抗生物素本身又是一个多价分子，每一亚基均可结合一个生物素分子，因此，这种方法可产生多级放大，使灵敏度提高10倍以上，并降低非特异性反应，把酶联免疫吸附技术又提高一步。具体方法如下：

先将第一特异抗体（兔抗体或鼠腹水抗体）包被在固相载体，加待检抗原，加第二特异性抗体（鼠腹水抗体或兔抗体），再加入相应生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶结合物，最后加入底物观察O.D.值。

（7）膜上斑点酶联法。

先用软铅笔在一张适宜大小的硝酸纤维素膜上划好边长1cm的方格网，把纤维素膜浸入TBS缓冲液漂洗30min，然后将膜放在两张滤纸之间，在室温下风干，用移液器将抗原抽提液滴在各方格中央，室温下风干，用TBS-T缓冲液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出后放在滤纸上至膜表面水滴消失，然后浸入封闭液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保温1h，取出晾干后，浸在用封闭液稀释的第一抗体溶液，在37℃下保温1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min换液一次。将膜浸入稀释度1/200的酶联球蛋白，室温保温1h，用上法洗膜后，用碱性磷酸酯酶缓冲液冲洗两次，每次10min，将膜浸入酶底物溶液内，室温下避光5～15min，显色完全后弃去底物液，用终止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜于滤纸内彻底风干后观察结果。

此法可克服塑料板的不足，只用目测就可对结果定性，不需要复杂的仪器，所需抗原抗体量均很少，灵敏度比常规酶联法高10倍以上，适合大量抗原的检测。

6.免疫电镜

电镜检测可快速确定病毒粒子的形状，是鉴定病毒不可缺少的技术，但有的样品浓度很低，用普通的电镜技术不易观察，如将病毒粒子包被后，抗体可把病毒粒子捕捉成聚集物便于观察。同时还可从病毒粒子与抗体的结合情况，观察两者间的血清学关系。通常使用的有以下几种方法：

（1）叶片浸沾血清技术。

把一滴稀释的抗血清，滴在有膜的铜网上，将叶片的新鲜切口浸入血清滴中1～2s，置于室温下5～10min，使血清与相应的病毒聚集并装饰起来，再进行负染检镜。

（2）Derrick氏法。

把火棉胶膜铜网在24℃下，置于按1∶10比例稀释于Tris缓冲液的抗血清内，然后将铜网用缓冲液冲洗后使用。把病毒的粗提液稀释于含HCl的Tris缓冲液内，将已用血清包被的铜网浮于0.1ml的病毒稀释液内1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水冲洗，然后干燥喷镀。

（3）聚集法。

把抗血清用磷酸缓冲液稀释到1/100的浓度，取10μl滴于载玻片，将切成2mm见方的病叶在血清滴中压碎，在湿室中保湿15min，用镊子持有膜铜网蘸取液滴，用20倍磷酸缓冲液冲洗后，再用蒸馏水洗，最后用5滴醋酸氧铀染色观察。

（4）修饰法。

取2mm见方的病叶在载玻片上的10μl蒸馏水中压碎，持有膜铜网沾此液滴，将病毒粒子吸附于铜网上，然后将铜网用20滴的磷酸缓冲液冲洗，吸去水分后加1滴稀释成1/100的抗血清，在湿室中保湿15min后，将铜网用20滴磷酸缓冲液和30滴蒸馏水冲洗，最后用醋酸氧铀染色检镜。

（5）诱捕修饰法。

先将铜网用稀释1/10或1/100的特异性抗血清包被，再把病毒样品滴于铜网，保湿15min，用缓冲液及蒸馏水冲洗吸干，再加1滴稀释成1/100的特异性抗血清，孵育15min后，用缓冲液和蒸馏水冲洗，吸干染色检镜。

（6）羊抗兔血清诱捕修饰法。

在诱捕修饰法未染色以前，再加1滴稀释1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗涤后染色镜检。此法因病毒粒子外壳包被有两层血清，明显加粗，在2000倍的低倍电镜下即可清晰地看到病毒粒子。

（7）A蛋白诱捕修饰法。

在福尔马膜的铜网上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育后洗去多余的A蛋白，再包被稀释100倍的特异性抗血清，滴加抗原，再滴加特异性抗血清，最后染色镜检。此法比一般诱捕修饰法灵敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

⑶ 植物病毒检测方法

植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。
1.4.1侵染力测定法
侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。
局部枯斑法 1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。
淀粉－碘斑法 当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。
侵染性滴度法 当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验植物，但可得到较好的结果。此方法可用于介体传染的病毒。

⑷ 花卉类病毒的诊断和鉴定方法有哪些

类病毒因为不具有外壳蛋白，所以不能用血清学、电镜等方法来诊断和检测。类病毒常用的检测方法有生物学检测、双向电泳、RT-PCR和分子杂交等方法。

1 生物学检测

利用类病毒的特异鉴别寄主来诊断和检测。如菊花矮化类病毒（CSVd），可以从待检样品中抽提低分子RNA，接种到特定的指不植物，如菊花的Mistletm品种、爪哇三七（Gynura auanyiana）、番茄（Lycopersicon esculentum）。接种缓冲液的组成是100mmolTris，10mmolEDTA，pH7.5。接种时用沾有接种原的刹须刀在菊花和爪哇三七的茎部轻轻切割5～10刀，再用棉棒涂抹。番茄可以用4～5叶期的幼苗直接用涂抹法接种。被接种植物放在30℃左右的温室培育，观察症状。接种36d后，菊花上出现黄色斑点，顶叶较少，从上数第3～5叶上症状更明显。接种45d后，爪哇三七出现顶叶卷曲症状。但没有柑橘裂皮病类病毒接种时症状明显。接种60d后，番茄上不表现任何症状。但回接菊花的Mistletm品种，证明CSVd在番茄上属于潜伏侵染。

生物检测需要严格的温度条件，如果温度条件控制不严格便难以得到可信的结果。此外，检测批量样品，还需要较大的空间。

22 双向电泳检测

2.1 核酸的抽提

抽提缓冲液的组成为0.13mol Tris-HCl、0.017mol EDTA、1mol LiCl、0.83%DS，5%PVP，简称为TESLP。1g鲜菊花叶片加2～5倍体积的TESLP缓冲液磨碎，加入等体积的水饱和酚∶氯仿（1∶1）处理，离心分离后用乙醇沉淀回收全核酸。之后用methoxy ethaml除去多糖，用CTAB回收核酸，加等体积的4mol的LiCl，离心回收2mol LiCl的可溶组分，用乙醇沉淀浓缩后溶于适当体积的TE（10mmol Tris-HCl，1mmol EDTA，pH8.0）溶液中。

2.2 正反向电泳

按照Singh等的方法进行。首先在室温下用1倍TBE电泳缓冲液分离核酸，直到染料XC-FF达近底部的7.5%为止。然后换成加热到沸腾的0.125倍TBE电泳缓冲液，颠倒正负极并用表面加热器保持电泳板的温度在80℃以上，直到染料XC-FF到达胶的上端。电泳完后用银染色观察核酸的有无（图1）。

图1 正反向电泳法检测菊花矮化类病毒RNA示意图

与生物接种相比，正反向电泳凝胶电泳检测菊花矮化类病毒，可以从相当于2.8mg鲜重的菊花样品中检测到菊花矮化类病毒CSVd，并同时可检测10～20个样品材料。总之，制备用于正反向电泳的粗核酸的方法简便，需要的鲜叶量少，可以作为该类病毒的常规检测方法。正反向电泳凝胶电泳与双向凝胶电泳比较，省去了第一项电泳完后割胶回收的试验步骤，操作更为简便。

⑸ 如何进行植物病害诊断和鉴定:

进行植物种植，传统的就是除草、浇水和防治病虫害，那么植物病虫害应该如何去防治呢？首先要知道如何辨别别植物病虫害，我们生产的植物病害检测仪可以迅速的将植物病虫害进行鉴别，不过这是建立在知道植物病虫害的发病机理上的，下面我们一起看下植物病虫害是如何被引发的。
一、非传染性病害：植物在不适宜的土壤上，或是遇到不适合的气候、水分、肥料过多过少等所引起的病害。如甜菜地里如果土壤中缺乏微量元素“硼”，就要引起甜菜根变黑腐烂，叫做缺硼病。这一类的病害不会传染蔓延，所以叫做非传染性病害。

二、传染性病害：是由病菌侵害发生的，能够传染，所以叫做传染性病害。这类病害种类最多。引起传染性病害的病菌大多数为真菌，其次就是病毒和细菌，以及线虫和寄生性种子植物等。
植物得病后，一般常见的症状有:变色、斑点、矮化、丛生、黄化、坏死、腐烂、萎蔫、缩叶、缩果、扭曲、瘤肿、畸形等。叶面上有时布满霉状物(黄色、红色、绿色等)、黑粉状物、白粉状物、锈状物以及小黑点等颗粒状物。
传染性病害中，由于病原菌不同，植物生病后，外部的形态改变也不一样，而且同一种寄生物在不同的植物上或者在同一植物的不同发育时期，以及受环境条件的影响，都可表现不同的症状。相反，不同的寄生物也可能引起相同的症状。因此，对植物病害除分析发病的原因外，还必须进一步鉴定病原生物，才能做出正确的诊断。对植物病害的诊断方法一般采用以下几个步骤：

1.症状诊断：
在诊断植物病害时，首先进行症状观察，根据症状特点，区别病害还是伤害。伤害是没有病变过程，病害是有病变过程的。如果是病害，还要区别是非传染性的，还是传染性的病害。在观察症状时，一般用扩大镜或用肉眼观察病株的外部表现，当外部症状不明显时，再进行病理解剖，检查内部症状。由于各种病害在田间的发生和发展其表现有一定的规律，因此在观察植物病害的症状时，应特别注意：
(1)病害的普遍性和严重性多；
(2)病害发展和在田间的分布；
(3)发生时期和植株生育期；
(4)受害寄主和部位位；
(5)栽培管理方法等。

病毒病害与非传染性病害容易混淆，因为病毒病害在外表看不出病症，区别病毒病与非传染性病害，除根据有无传染现象外，还可根据病害的发生特点。非传染性病害在田间大都是普遍、均匀、成片发生，发病地点与地形土质或环境条件有关。病毒病害在田间多是分散发生，在病株周围可找到健株，其症状除呈现花叶、黄化或矮缩畸形外，还常与传毒昆虫的活动有密切关系。

2.病原鉴定：
鉴定病原是对植物病害进行诊断最可靠的方法。对不同性质的炳原必须采取不同的鉴定方法。
(1)非传染性病害的病原鉴定
在对养分、水分、温湿度和厌围环境条件进行分析的基础上，可进行化学诊断，就是将有病的植物榨出液或病土进行分析，测定矿物营养(如氮、磷、钾、硫、铁以及其他微量元素的含量)，是否符合健康植物的标准，并查明所缺元素。其次还可以进行人工诱发试验，如水培法和砂培法，人为的提供可疑的类似条件，观察是否发病。
(2)传染性病害的病原鉴定
①病毒病害的病原鉴定

病毒病害的病原用普通显微镜观察不到组织病变。目前在电子显微镜还不普及的情况下，多采用人工接种试验来验证。人工接种试验是用病株汁液磨擦接种、嫁接、昆虫传染等方法。同时还可以根据病毒的生物学特性，如传播方法、寄主范围、寄主反应、体外保毒期、稀释终点以及血清方法等来区别病毒的种类。有些植物病毒还可以采用指示物进行鉴定。
②细菌病害的病原鉴定

对细菌病害的病原鉴定，多采用“细菌溢”的方法。具体是切取小块病组织制片，放载玻片于显微镜下检查，如觉现有“细菌溢”从病组织(维管束)涌出，即可勿步确定为细菌病害。
如果鉴定细菌的种类，就可进行革兰氏染色，通过阳性和阴性反立来区别。此外还可以进行分离培养，获得较纯的培养菌种，然后通过伤口或白然孔(水孔、皮孔、气孔等)人工接种，来确定细菌的种类。

目前，对细菌病害病原的鉴定，较迅速准确的方法是采用血清反应。具体方法是取一定病原的细菌液少许放载玻片上，然后加入某种用生理盐水稀释过的“抗血清”，如果两者产生“凝集”即证明是某细菌病害的病原。例如鉴定马铃薯环腐病的病原菌时，可将已培养好的环腐病细菌液注射到兔子体内，然后抽取兔子血液，使沉淀后取上部的血清(即抗血清)，用生理盐水稀释后放载玻片上，与被怀疑为马铃薯环腐病的病原细菌掖混合，如产生“凝集”，即证明为环腐病病原。否则为非环腐病病原。
③真菌病害的病原鉴定

鉴定真菌病害，一般常用的方法是挑取病株组织上的菌丝或子实体制片，然后置显微镜下观察病菌的形态、特征、色泽、大小、结构等。其次是采用分离培养和接种试验。分离培养是切取小块病株组织经表面消毒和灭菌水洗后，移到一定的培养基平板上，在一定的恒温下培养，几天后观察菌落、菌丝体、无性抱子、有性抱子等形态、色泽。接种试验应根据真菌病害不同的侵染类型，将病菌抱子进行拌种、花器接种、土壤接种、涂抹接种或将抱子棍悬液进行喷雾接种。
④线虫病害的病原鉴定

植物受线虫为害后，多在受害部位产生虫廖或膨胀的形态变化，剖切虫瘦或膨胀部分用针挑取内部含有物制片，然后放显微镜下观察有否线虫及形态特征。有些线虫病并不引起植物形态变化，可采用漏斗分离法和叶片染色法进行检查，作出诊断结果。