① 酶活性分析的常用方法
一、量气法
在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很容易计算出气体变化量，这是量气法的基本原理。曾在检验科广泛应用的Van-slyke测二氧化碳结合力的方法就是量气法的一个典型例子。Warburg进一步加以发展，设计出专用于测定酶活性的华勃呼吸仪。这种仪器特别适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶，例如氧化酶反应涉及到O2的消耗，脱羧酶会产生CO2。但也不仅限于这些酶，科学家采用与CO2气体保持平衡过的重碳酸盐体系，可用来测定各种产生H+的酶反应，如各种还原酶，可使NADH变为NAD和H+，而H+会促使反应体系中重碳酸盐变为CO2气体。
二、比色法与分光光度法
在20世纪上半个世纪华勃仪得到研究实验室广泛的应用，并在酶学上得到丰硕的成果。但此法操作烦琐，技术要求高而且灵敏度低。临床常规中很少使用。多使用简单易行的比色法测酶活性。在上半个世纪建立了一些适用于常规工作的测酶活性浓度的方法，如测定淀粉酶的Somogyi法，碱性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。这些方法都是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色，同时将被测物质作标准管或标准曲线，比较后计算出在此段时间内产物生成量或底物消耗量，从而求得反应速率v。
比色法从50年代起逐步被分光光度法所取代。这是因为分光光度法有以下几个显着优点：一是测定范围不只局限在可见光，还可扩展到紫外和红外部分。这就为扩大测定酶范围提供了可能性。二是提供了寻找一类不需停止酶反应就可直接测定产物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反应A－＞B＋C，A、B、C三种物质用分光光度法的吸收光谱如图17-1所示。
图17-1 A、B、C三种物质的吸收曲线
可以看到C在560nm处有一吸收峰，而A和B在此处无吸光度变化因此无需停止酶反应，只要在560nm处测定吸光度变化就很容易计算出C的变化速度，而且C物质比A、B二物质有更高的吸收峰，即灵敏度最高。
这类方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光谱差异建立的测酶活性浓度方法。NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P）在此波段却毫无吸光性。因此建立了一类和原来比色法截然不同方法。不需停止酶反应，在340nm根据吸光度变化，就可观察到酶反应变化全过程。
第三个优点是不需要如比色法那样，作标准管或标准曲线，因为分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下，某一特定物质的吸光度为常数，即人们所熟悉的摩尔吸光度（molar absorbance）。根据此值从吸光度△A/△T不难计算出酶催化反应速度v。
分光光度计的这些简便、准确等特点使它在近年来已逐步取代比色法而成为目前最流行的方法。其缺点是需要精确带恒温装置的分光光度计，在经济不发达地区尚难推广。
分光光度法的技术多样化。设计得当可用于各种酶的测定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化还原物质特性。
除了前述的NAD(P)H系统可用于脱氢酶测定外，可利用黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）来测定各种含这二个辅基的酶。它们的氧化型在450nm有一很强吸收峰，而还原型的吸光度很低，同样细胞色素还原型在可见光有一个非常明显和很窄的吸收峰，都使人们很容易用分光光度法研究这些酶的作用。上述物质主要用于氧化还原酶的测定。
科学家还设计出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法测定。例如合成了很多对硝基酚的衍生物，用于各种水解酶的测定。碱性磷酸酶底物磷酸对硝基酚就是一个成功例子。又如测芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸对硝基酚为底物，其分解产物的吸收峰由原来的278nm变为318nm，Webb成功地在330nm进行此酶监测
表17-2 一些氧化还原物质的特性
物质 波长（nm） 克分子吸光度
还原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
细胞色素C 550 29500 8300
亚甲蓝（等消光点） 610 0 41000
二氢酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗坏血酸 265 15100
连二亚硫酸盐 314 8000 0
氰化铁（亚铁） 420 0 1020
分光光度法的上述原理还可以用于其它酶的测定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不饱和键，在330nm处有很强吸收峰，而酶作用产物无此不饱和键。则不难在330nm处对这些酶进行直接测定。
此后在分光光度法的发展过程中又导入了酶偶联技术。使得分光光度法几乎能测定所有的酶。因此临床实验室工作者如不能很好掌握分光光度法的技术，不了解各种影响因素，要作好酶的测定是很困难的。
三、荧光法和同位素法
分光光度法有一个缺点，即灵敏度较低。有些标本中酶浓度很低时往往测不出来。此时可考虑改用荧光法，可将测定灵敏度提高2-3个数量级。如科学家合成了一系列甲基伞形酮的衍生物，可取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶的底物，由于水解产物甲基伞形酮有强烈荧光，大大提高测定的灵敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反应系统，也可改用荧光法，在340nm紫外线激发下NAD(P)H产生强烈的蓝色荧光，而NAD(P)不被激发。此外，还可使用在荧光法基础上发展起来的时间分辨荧光法，例如北京医院就曾利用此种灵敏度极高方法测定很难用其它方法检测的脑脊液中微量的烯醇化酶。荧光法不易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准，故此种方法多用于研究实验室，少用于常规实验室。为提高灵敏度，还可使用同位素标记的底物进行酶测定，例如，有人以C12标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶，在酶作用后以离子交换法分离出含C14的乙酸。同位素方法由于对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。
四、其它方法
离子选择电极法，旋光法等有时用于测定特定的酶，当酶反应牵涉到有酸碱变化时，很容易用pH仪直接观察酶反应过程中H+的变化。直接用pH仪测酶反应有两个缺点：一是随pH变化，会偏离酶作用的最适pH值，不可避免地引起酶反应速度变慢。其二是如测定的标本不是纯酶时标本中其他蛋白及其它有缓衡能力的物质将会影响所测pH变化的程度。此时如改用电位滴定仪则更为适合。此仪器可在酶反应过程中不断向反应体系中加入酸或碱以维持反应体系pH的恒定，而加入的酸碱量只与体系中H+变化量相关，和反应体系中缓衡能力无关。
同样如酶反应中有O2变化，可使用氧电极来监测酶反应过程，这可用来测定葡萄糖氧化酶活性，Chappell还成功地将此技术用于测线粒体的氧化能力。还曾有人尝试用二氧化碳和氨电极测酶，由于这些电极反应时间较慢，不利于检测酶反应速度。有些酶的反应物为光学异构体，则可根据旋光度变化来追踪酶反应。某些反应物如羟基酸本身虽无旋光性，但与钼结合后产生很高的旋光性。根据此特性建立了测定延胡索酸水合酶的方法。还有个别酶的测定使用了极谱法、高效液相色谱法等。总之，实验室工作者完全可以根据实验室现有仪器和技术，创造性地建立一些新的测活性浓度的方法。
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低.根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性.
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L
pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L
H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）.
【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2～3ml
4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度.混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液.5℃下保存备用.
2.测定：取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表40-2顺序加入试剂.
表40-2
紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管
号
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性.
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）.
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中
A240
=
AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1,
AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）.
③ 如何从发酵液中分离一个蛋白酶如何测定其表达量和酶活
首先，去除菌体和残余的发酵液，一般高速离心就可以，5000r/min离心1min.取上清。此部要根据蛋白质的特点来做。若果蛋白酶是在细胞内那么要先破碎细胞，如果该酶的分子量过大，那么要减小离心转速。
其次，蛋白酶溶液中根据酶的性质，处理纯化或提取。常用方法是有机溶剂提取法，阴、阳离子交换柱层析发，液相色谱法等。这要根据蛋白质的性质，是否带电荷带什么电荷等。
关于酶活，应该每一步都要测定酶活，可用该酶分解蛋白质的特点，看一定的酶量在单位时间里分解蛋白的量，如果有特殊吸收峰的话可用紫外分光光度计测吸光度。
表达量，一般定量表达，常用方法是基因水平Realtime-PCR，蛋白水平，westen-blot法。也可参考其他相关文献的方法。
④ sod酶活性测定方法
1、测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
2、在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
（1）改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
（2）化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。（3）Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
（4）亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。
⑤ 酶活力的测定方法及原理
酶活力的测定方法：有两种主要方法即终止反应法和连续反应法。
终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。
连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
酶活性测定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。
2. 过氧化氢酶（Catalase，CAT）
活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
4. 过氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
⑥ 怎样消除（或中和、分解、）β-内酰胺酶有没有检测β-内酰胺酶的简单方法谢谢~~！
一、消除：
暂时没有什么有效的针对性清除办法，比较可行的是使用舒巴坦（Sulbactam）之类的不可逆竞争性β-内酰胺酶抑制剂。前者和β-内酰胺酶发生不可逆的酰化反应使酶失活,当抑制剂去除后酶的活性也不能恢复，其作用比较显着。
二、检测：
1.常规方法
(1).微生物法：
[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。
[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼升凯唤脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。
[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕。
(2).碘量法[3]
[原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。
[方法]
①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml于一小试管中。孙团
②将培养18-24小时的细菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液（109/ ml）。
③在37℃水浴中吵凯放置30分钟，不时摇动，使酶能破坏青霉素。
④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml，摇匀。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分钟，观察结果。
[结果] 在10分钟内能使兰色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。
[注意事项]
①由于青霉素很容易分解，因而用于实验的青霉素应新鲜配制。
②淀粉也新鲜配制，在100 ml蒸馏水中加入1克可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。
③实验应按照步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。
④每次试验最好用阳性和阴性对照。
（3）.纸片酸度定量法[3]
[原理] β-内酰胺酶能破坏青霉素中的β-内酰胺环，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示剂溴甲酚紫颜色由紫变黄。
[方法]
①将一小片Whatman滤纸放于空平皿中。
②让滤纸吸足青霉素溶液（0.05M磷酸缓冲液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%无缓冲剂的结晶青霉素）。
③用接种环把10-20个菌落涂到滤纸上，
④盖好平皿后，将滤纸片在37℃孵育30分钟，观察结果。
[结果] 产β-内酰胺酶的菌株使滤纸颜色由兰色变黄色，一般在10分钟内即能看到。
（4）.产色头胞菌素法[4]
[原理] 产色头胞菌素如头胞硝噻吩（nitrocefin）的β-内酰胺环能被β-内酰胺酶所破坏，使其颜色由浅黄色变为粉红色，以此来测定细菌的产酶情况。
[方法] 将头胞硝噻吩（nitrocefin）纸片置于干净的平皿内，用无菌的牙签或接种环挑取细菌菌落涂于纸片上，观察纸片有无颜色变化。
[结果] 纸片涂抹处如颜色由浅黄色变成粉红色，表示该菌产生β-内酰胺酶，如颜色不变，表示细菌不产生β-内酰胺酶。
检测β-内酰胺酶方法中，生物学方法是古老的方法，由于特异性差、灵敏度低，现在基本上很少被采用，头胞硝噻吩（nitrocefin）主要检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）、葡萄球菌，结果可靠。纸片酸度定量法一般用于检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌。碘量法常用于检测淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉汉氏菌）只能用头胞硝噻吩（nitrocefin）法。
对于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）快速测定β-内酰胺酶比做药敏试验能更快地得到临床需要的结果。β-内酰胺酶试验还可验证葡萄球菌对纸片法青霉素的敏感试验结果是否可信。肠杆菌科、假单胞菌科及其它需氧革兰氏阴性杆菌不必测定β-内酰胺酶，因其结果常常不能预测这类细菌对临床常用来治疗β-内酰胺类抗生素药物的敏感性[5]。