㈠ 粪大肠菌群的测定
粪大肠菌群
Fecal Coliforms
1 定义
本规范采用下列定义
粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。
该菌直接来自粪便，是重要的卫生指示菌。
3 仪器
3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。
3.2 温度计。
3.3 显微镜。
3.4 载玻片。
3.5 接种环。
3.6 电磁炉。
3.7 三角瓶，250mL。
3.8 试管：15×150mm。
3.9 小倒管。
3.10 pH计或pH试纸。
3.11 高压灭菌器。
3.12 灭菌吸管，10mL、1mL。
3.13 灭菌平皿：直径90mm。
4 培养基和试剂
4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基
成分：蛋白胨 40g
猪胆盐 10g
乳糖 10g
0.4％溴甲酚紫水溶液 5mL
卵磷脂 2g
吐温80 14g
蒸馏水 1000mL
制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH到7.4，加入0.4％溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。68.95kPa（115℃ 10 lb）20min灭菌。
4.2 伊红美兰（EMB）琼脂
成分：蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 20g
2％伊红水溶液 20mL
0.5％美蓝水溶液 13mL
蒸馏水 1000mL
制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4，分装于三角瓶内，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。
4.3 蛋白胨水（作靛基质试验用）
成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min高压灭菌。
4.4 靛基质试剂
柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
4.5 革兰氏染色液：
4.5.1 染液制备
4.5.1.1 结晶紫染色液：
结晶紫 1g
95％乙醇 20mL
1％草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.5.1.2 革兰氏碘液：
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水加至 300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
4.5.1.3 脱色液：95％乙醇。
4.5.1.4 复染液：
a 沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95％乙醇 10mL
蒸馏水 90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
b 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95％乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5％石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。
4.5.2 染色法
4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
4.5.2.3 滴加95％乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。
4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
4.5.3 染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。
5 操作步骤
5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h±2h。
经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。
5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。
5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。
6 检验结果报告
根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
㈡ 谁给说下环氧乙烷残留量原始方法怎么检测
1. 目的
连同生物试验一起，证明经环氧乙烷灭菌的医疗器械产品是否可用。
2. 适用范围
适合经环氧乙烷灭菌的产品经解析后的环氧乙烷残留量检测。
3. 检测依据
GB/T 16886.7-2001医疗器械生物学评价 第七部分
ISO 10993.7-2008 EO灭菌残留量
4. 使用仪器
仪器名称 型号 备注
气相色谱仪 GC5890C FID检测器
氮氢空一体机 中芯惠利
毛细色谱柱 TM-624 0.5um*30m
水浴锅 /
顶空进样瓶 20mL
硅胶封口垫 聚四氟乙烯膜
一次性注射器 1mL
分析天平 / 精度0.1mg
容量瓶 50mL/100mL
4. 操作过程
4.1 样品处理：
将样品透析包装打开，选取易于拆卸、剪取及不易于环氧乙烷解析处的部位，将样品剪成5mm长碎块，取1.0g样品1份，放入20mL顶空进样瓶，加纯水5mL，密封，放入恒温60℃±1℃水浴中浸提40min。
4.2 抽样频次
从每个灭菌批次的产品中随机抽样。一般情况下，每个灭菌批次随机抽样数量为5只。
4.3 环氧乙烷标准贮备液的制备
取外部干燥的50 mL容量瓶，加水20～30 mL，加瓶塞，称重，精确到0.1mg。用注射器注入约0.1mL环氧乙烷，不加瓶塞，轻轻摇匀，盖好瓶塞，称重，前后两次称重之差，即为溶液中所含环氧乙烷的重量。计算出贮备液浓度，4℃以下保存备用。
4.4 标准工作液制备
各取1mL贮备液分别配制1×10-3g/L、2×10-3g/L、4×10-3g/L、6×10-3g/L、8×10-3g/L、1×10-2g/L六个系列浓度的标准溶液。密封，备用。各取5mL按4.1方法处理。
5. 气相色谱仪操作
5.1 将氮氢空一体机打开电源，将右侧氮气放气阀打开至少30min，闭合使氮气和氢气气压恢复至0.4MPa。
5.2 将气体净化阀打开。
5.3 打开气相色谱仪电源和工作站软件，待气压和流速平衡后，按点火按钮，观察基线变化及FID检测口是否产生蒸汽。
5.4 参数设定
参数 毛细柱
温度 汽化器
温度 FID检测器
温度 解析时间 进样量
设定值 50℃ 140℃ 140℃ 12h 0.5uL
5.5 将样品与实验用标准品放置于60℃±1℃水浴中，平衡至少40min。
5.6 用玻璃注射器从平衡后的标准品和样品中迅速抽取1mL上部气体，插入毛细管柱进样口，进样，然后点击操作面板上的“确定”按键（进样时应注意进样速度，防止气体逸散及回退）。
5.7 选择标准品图谱，校正标准曲线。将样品图谱代入标准曲线（X：EO浓度，g/L；Y：峰高或面积），根据样品与纯水稀释比例为1：5，计算出样品中环氧乙烷残留量。
5.8 结果计算
WEO = [浸提液体积×（EO出峰面积-125.1）/194.34]/浸提样品的重量
6. 结果判定
依据GB/T16886.7—2001 医疗器械环氧乙烷灭菌残留量标准，短期接触器械环氧乙烷残留量应≤10ppm。
7. 注意事项
7.1 气相色谱仪中FID检测器关火时应先关闭氢气通路，然后关闭空气通路。
7.2 气相色谱仪在关机前，应将进样口、柱温箱和FID检测器温度降至室温或低于50℃才可关机。
7.3 制备样品的分析人员进行的所有工作，包括化学试剂的使用，应在通风橱内进行，并穿戴防护衣。使用化学药品之前应阅读材料安全方面的说明。
7.4 在一个分析中尽量同一人操作，并使用同一只1mL玻璃注射器，注射器预先恒温到样品相同温度。
7.5 每次注意环氧乙烷保留时间的变化，以防进样气化垫漏气。
7.6 每个样品（包括标样）在尽可能短的时间内分析三次，三次分析中必须有两次结果相差≤5%，否则样品应重新进行分析。
㈢ 1%卵磷脂+0.1%吐温80配制方法
卵磷脂1g,吐温800.1ml，加蒸馏水至100ml，121度高压灭菌15分钟,即可。
1%的卵磷脂+0.1%吐温80配制方法:卵磷脂1g ,吐温80，0.1ml加蒸馏水至100ml，121度高压灭菌15分钟,即可。1.5%硫代硫酸钠配制方法:取硫代硫酸钠1.5g ,加纯化水稀释至100ml。
卵磷脂，又称为蛋烂大春黄素，存在于饥耐动植物组织及卵黄中的一组黄褐色的油脂性物质。构成成分包括磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯及磷脂。吐温（或聚山梨酯）为非离子型仿清表面活性剂，有异臭，温暖而微苦，系一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯。
㈣ 水中粪大肠菌群的测定
化妆品检测项目中粪大肠菌群的检测流程：
10g/mL样品+90mL灭菌生理盐水 →10mL+10mL双倍乳糖胆（含中和剂）培养基→粪大肠菌群 44.5℃，48h培养
注：在化妆品检测项目中，如果样品含有油脂性的成分，如精油，在样品前处理中需加入液体石蜡、吐温80、生理盐水进行均质，使样品能够均匀分散开来。
粪大肠菌群又是一个什么样的微生物呢？下面我们来详细介绍下：
大肠菌群：大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
定义（GB2010）：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
粪大肠菌群：大肠菌群的一种，又称耐热大肠菌群，培养温度：44.5±0.5℃，粪大肠菌群是化妆品检测项目中必检的微生物项目。
大肠埃希氏菌：（(Escherichia. coli )通常称为大肠杆菌。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：
致病性大肠杆菌(EPEC)、
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、
肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、
肠出血性大肠杆菌(EHEC)、
肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。
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㈤ 什么是无菌检查法
无菌检查法
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)
酪胨（胰酶水解）
15g
氯化钠
2.5g
葡萄糖
5g
新鲜配制的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml)
硫乙醇酸钠
0.5g
琼酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
在无菌检查接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。
2.霉菌培养基
胨
5g
磷酸氢二钾（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸馏水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。
3.选择性培养基
(1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2) 吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装，115℃灭菌30分钟。
4.营养肉汤培养基
胨
10g
肉浸液
1000ml
氯化钠
5g
取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
5.营养琼脂培养基
照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5％葡萄糖肉汤培养基
胨
10g
葡萄糖
5g
氯化钠
5g
肉浸液
1000ml
取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，115℃灭菌30分钟。
7.霉菌琼脂培养基
照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。
培养基的质量应通过灵敏度检查。
培养基灵敏度检查法
1.菌种
(1)藤黄微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]
(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物,吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标 准管相同的浓度，然后，作10倍系列稀释并计数。
将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。
3.结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种菌量均应小于10个），三次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判定标准。
需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。
[附注]
肉浸液制备法
取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后,每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
对照用菌液
1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内,在30～35℃培养16～18小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。
检查法
1. 直接接种法
(1) 供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 任取供试品2支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照, 另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量,按下列规定取用：
供试品装量
每管接种量
培养基分装量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接种后轻轻摇动,使匀。需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日, 霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时,可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
(2) 供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
(3) 供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
(4) 供试品如为外科敷料，取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装,于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
(5) 供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
(6) 供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下,取最大规格量2份，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。
(7) 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
2. 薄膜过滤法
(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下取最大规格量2份, 分别按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9％灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中, 摇匀, 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后,用0.9％灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜,分成4片, 取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中, 其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照, 另1片放在霉菌培养基管中。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(2) 供试品如为抗厌氧菌药品，取规定量的供试品，按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中，1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。另1片放在霉菌培养基管中。 取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(3) 供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜,分成4片，取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中,其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时,可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。