微孔板生物检测方法

㈠ 简述检测蛋白质磷酸化的检测方法及其原理

方法及原理：
1.激酶活性分析
生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。
直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳，这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。
2.WesternBlot
利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上（通常是PVDF或尼龙膜），之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平（而不考虑磷酸化状态），以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。化学发光和显色法都很常用，而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。
3.酶联免疫吸附分析（ELISA）
ELISA的定量能力优于Westernblot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品（如细胞裂解液）中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。
4.基于细胞的ELISA
来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，并比较多个样品，与传统免疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要，因此更适合高通量分析。
5.质谱
首先，磷酸化肽段的信号通常较弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。
6.多个分析物图谱分析

㈡ 食品微生物检验内容与检测技术方法

食品微生物检验内容与检测技术方法

近年来，世界各地出现了诸多严重的食品安全事故，由于食品微生物污染而造成的质量事故严重威胁着人们的身体健康，如何做好食品微生物检验，确保食品质量安全，就需要社会各界共同努力。根据国际和国内卫生组织的相关规定和要求，所有的食品生产厂商都要对食品的质量进行严格的检验，对于生产出来食品的菌落种类、细菌数量、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等进行检测，必须达到要求的合格标准才能进入市场进行出售。下面是我为大家带来的食品微生物检验内容与检测技术方法的知识，欢迎阅读。

需要注意的问题

一是工作人员及活动规定。必须保证参加检测的人员具有相应的资格，并通过相关的考试后，持证上岗才能开展相关活动。同时要求工作人员不仅需要具有高超的专业技术，还应该有良好的职业道德修养，尽可能降低人为问题的制约。检测过程需要按照相关的活动规范和流程进行，使用无菌设备认真地进行抽样活动，采用先进技术获取相关信息。二是存放装置。若想检测过程顺利进行，除了确保实验室有必要的设施外，还应该重点考虑装置存放的条件和要求。三是装置和药品的配置。在各项装置进行安装时应该对气温进行调节，确保其安稳，对装置气温稳定性合乎规定要用的具体时间详细记录。同时在规定的时间内对各种装置进行消毒处理，并通过感应设备对其运作状态进行监测。对于药品的配置，培养基往往在121℃下采用高压湿热灭菌法灭菌15分钟;较为敏感的'培养基一般采用膜过滤法。四是样本的处理。在样本收集过程中，需要确保抽样活动是在无菌环境下展开的，有效避免了样本被污染。在样本输送时，应该防止样本受到光线的影响而出现污染现象，抽样之后就应该及时将其送至测试场地。一般样本输送时间要控制在3h内，如果无法及时送到，要确保在近乎之前的气温时将其完整的存放。

食品微生物检验内容

一是检验食品污染程度指示菌。细菌总数即菌落总数，是食品和生活饮用水检样处理后，在特定培养条件下，所得1g或者1mc检样中所含有的细菌菌落个数，这就是判断食品和生活饮用水污染程度的关键指标。大肠菌群系是在37℃下培养24h的一群发酵乳糖、产气、产配以及需氧或者厌氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。这种菌群主要来源于人和牲畜的粪便，因此，可以用粪便的污染指标菌对食品的卫生质量进行评价。二是检测食品中治病菌。在食品微生物相关检验标准中已经明确规定某些微生物的数量，因此在对食品污染程度指示菌检测的同时，还应该对一些治病菌进行测定，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。

食品微生物检测技术方法

很长时间以来，开展的此项检测活动，是按照琼脂平板的措施来进行的，通常要两到三天的时间才可以完成。最近，许多的专家和组织都不断地对工艺以及措施进行深化分析，获取了非常高的成就，对许多措施进行了改进，切实提升了检测的精准性以及安稳性特征，而且获取了许多全新的工艺，具体有如下的措施：

1.采用电阻抗法。具体的讲，它是指细菌繁衍的时候，将会使培养基中的火分电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，其能增加培养基的导电性，进而导致阻抗出现改变，因此，可以通过检测培养基的电阻抗变化情况来判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。

2.采用快速酶触反应及代谢产物的检测。细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，所以根据其特性来选用相对应的底物和指示剂，而且合理的记载信息。

3.采用分子生物学技术。它涵盖两项内容：1)核酸探针技术。结合碱基互补相关的概念，使用独特的措施来对物体进行标注。2)聚合酶链式反应(PCR)技术。其原理为通过加热使双链DNA经裂解成两条单链，成为引物和DNA聚合酶的模板;接下来把气温变低，使寡聚核苷酸引物与DNA分子上的互补序列退火。通常状态中，当退火的气温非常高的话，它的扩增特性就十分的优秀。

4.采用免疫学方法检测细菌抗原和抗体的技术。具体有三项措施：1)荧光抗体检测技术(IFA)，它又有两种，分别是直接的以及间接地。其中第一种是直接在样本上滴加已知特异性荧光标记的抗血清，然后对其清洗，进而获取信息。而后一种措施是在检样上滴加已知细菌特异性抗血清，等到发生反映之后再仔细地清洗，再加入荧光标记的抗体后在荧光显微镜下观察结果。2)免疫酶技术(EIA)，其是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用原理结合，此法非常的独特，而且功效非常好。通过共价结合将酶与抗原或抗体结合，形成酶标抗原或抗体，或通过免疫方法使酶与抗酶抗体结合，形成酶抗体复合物。3)免疫磁珠分离法(IMS)，即应用抗体包被的免疫磁珠，用一个磁场装置收集铁珠。

5.采用仪器法。1)微型全自动荧光酶标分析仪(Mini-VIDAS)，其主要采用具有优异的敏感性和特异性的酶联荧光技术(ELFA)，得到的荧光和抗原的比例是一种顺向的关系。2)全自动微生物分析系统(Vietk-AMS)。它能够一次对非常多的样本开展分析，而且检测的时间不需要非常久，通常在两到三个小时即可，此法的效率非常好，同时也将成为检测行业全行的发展趋势。

㈢ HIV核酸检测的HIV核酸检测方法及程序

1.1 方法和试剂
1.1.1 方法
（1）检测方法为商品化试剂盒和实验室自建方法，商品化试剂应严格按说明书操作。下面介绍的方法是实验室自建方法，供参考。
（2）检测血浆或血清样品使用逆转录PCR（RT-PCR）方法，建议第一轮PCR扩增使用RT-PCR一步法；检测血细胞或组织样品使用PCR方法。一般使用扩增两轮的套式PCR方法。
（3）设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因的样品；阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因的样品。阳性和阴性对照样品应与待检样品处理程序一致。阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。
1.1.2 试剂
（1）PCR引物：一般使用扩增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。进行RNA逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计，应尽量涵盖常见的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。
（2）主要试剂：包括核酸提取纯化、逆转录、PCR所需的试剂。使用商品化核酸提取纯化试剂、逆转录酶反应试剂和PCR扩增试剂。
（3）抗污染试剂：实验室自建检测方法可使用抗污染试剂，参考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
1.2 扩增目的基因片段
1.2.1 样品的采集和处理
1.2.2 核酸提取
可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
1.2.3 逆转录合成cDNA
使用商品化试剂并按说明书操作。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。
1.2.4 PCR扩增反应
使用商品化试剂按说明书操作。PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板（DNA或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。一般使用二次扩增的套式PCR扩增方法。
1.3 扩增产物分析及结果报告
1.3.1 扩增产物分析
扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。
1.3.2 结果判定和报告
（1）实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。
（2）HIV核酸检测阳性：使用商品化检测试剂，发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。
（3）HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。
（4）应在完成检测后7个工作日内发出检测报告。 2.1 方法
HIV核酸定量检测主要基于靶核酸扩增RT-PCR和信号放大扩增两种方法。国内常用的方法中，NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1采用国际单位（IU/ml），与NASBA的拷贝数关系基本为1:1；Amplicor Cobas 的拷贝数约为1.2～1.5国际单位；bDNA方法的拷贝数约为0.8～1.0国际单位。不同方法的关系与HIV的亚型有关。
2.2 试剂
必须使用经中国药品生物制品监督管理局注册批准的商品化试剂并严格按说明书操作。
2.2.1 靶核酸扩增试剂和性能
（1）RT-PCR扩增试剂
1）Amplicor HIV-1 Monitor v1.5（RT-PCR微孔板捕获比色分析法），核酸手工提取（异丙醇沉淀），比色分析测定。扩增靶核酸位置是gag基因区，可扩增HIV-1M组的A-H基因亚型。标准法的检测线性范围是400～750，000；超敏法的线性范围是50～100，000 RNA拷贝/毫升。
2）COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5, 核酸手工提取（异丙醇沉淀），仪器测定。扩增靶核酸位置是gag基因区，可扩增HIV-1M组的A-H基因亚型。标准法的检测线性范围是400～750，000；超敏法的线性范围是50～100，000 RNA拷贝/毫升。
3）COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 （COBAS Amplicor 分析仪）,仪器提取核酸，仪器测定。扩增靶核酸位置是gag基因区，可扩增HIV-1M组的A-H基因亚型。标准方法的检测线性范围是400～1，000，000；超敏方法的线性范围是50～100，000 RNA拷贝/毫升。
以上三种试剂均采用基于PCR扩增靶核酸检测法，仅在设备的使用、自动化程度和样品制备的方法有所不同。
4）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test（实时荧光探针RT-PCR分析法）, 仪器提取核酸,实时荧光探针PCR扩增仪器测定。扩增靶核酸位置是gag基因区，可扩增HIV-1M组的A-H基因亚型。检测线性范围是40～10，000，000 RNA拷贝/毫升，比上述三种方法的检测线性范围要宽，样品可不经稀释一次完成检测。
以上四种试剂均使用一个内部定量标准品，1个阴性、1个弱阳性和1个强阳性外部外部质控品。均使用dUTP/UNG防污染试剂。
5）LCx HIV RNA Quantitative Assay（竞争性RT-PCR微颗粒酶免疫分析法）,手工或仪器提取核酸（活化硅胶柱纯化），仪器测定。扩增靶核酸位置是pol（整合酶）基因区，可扩增HIV-1基因M组的A-G亚型和0组病毒，尤其可检测M组C基因亚型和一些重组病毒。检测线性范围是50～1，000，000 RNA 拷贝/毫升；使用一个内部定量标准品和六个外部定量标准品。
6）RealTime HIV-1 Assay（实时荧光探针RT-PCR分析法）,使用独特的双链荧光探针。手工或仪器提取核酸（磁性颗粒纯化），仪器测定。扩增靶核酸位置是pol（整合酶）基因区，扩增HIV-1基因亚型是M组的A-G亚型和0组以及N组病毒。检测线性范围是40～1，000，000 RNA 拷贝/毫升。使用一个内部定量标准品。检测结果与LCx HIV RNA Quantitative Assay结果高度相关。
（2）基于核酸序列扩增试剂（NASBA扩增技术）：以等温方式直接扩增HIV-1 RNA。
NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1（实时荧光探针分析法）, 使用荧光标记的分子信标探针技术检测扩增子。手工或仪器提取核酸（硅胶纯化，异丙醇沉淀）,仪器测定。扩增靶核酸位置是gag基因区，扩增HIV-1基因亚型是M组的A-G亚型。检测线性范围是50～3，000，000 RNA 国际单位/毫升；使用一个内部定量标准品，没有阴阳性外部外部质控品。每次检测8的整数倍样品，直至48个。检测结果与Versant HIV-1 RNA、和Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 方法的结果有着高度的相关性。国际上已经推荐使用V2.0试剂盒。
2.2.2 信号放大扩增试剂和性能
Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA（分枝状DNA探针杂交微孔板捕获比色分析法）, 利用分枝状DNA多级信号放大原理。无需RNA纯化和PCR扩增步骤。离心浓缩病毒子并用去垢剂和蛋白酶K消化病毒释放病毒RNA，仪器测定。扩增靶核酸位置是pol基因区，扩增HIV-1基因亚型是M组的A-H亚型，检测线性范围是50～500，000 RNA 拷贝/毫升；使用六个外部定量标准品，1个阴性、1个弱阳性和1个强阳性外部外部质控品。每次可检测12的整数倍样品。
以上试剂均可使用EDTA和ACD作为样品的抗凝剂，NucliSens HIV-1 QT和NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1以及Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA试剂还可以使用肝素作为抗凝剂。如果必须使用经肝素处理的血浆样品进行RT-PCR扩增，则必须在样品中直接加肝素酶消化肝素。
2.2.3 实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR扩增的实验检测过程可分为：（1）样品制备,抽提和浓缩目标RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。检测的原理基于荧光信号增长曲线与循环数相关。（3）RT-PCR反应，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后通过DNA聚合酶对特定片段进行扩增。（4）扩增产物的检测，基于检测阈值的设定，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品载量成线性关系。利用标准品制作循环数与载量的标准曲线就能对样品载量进行定量检测。 使用集合核酸扩增检测技术和方法，利用核酸检测方法的高度敏感性，对高度怀疑感染人群且抗体阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期感染者。该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。
3.1 样品集合程序
3.1.1 根据预处理样品量，计算预形成一级和二级集合数量，在登记表格上记录一级和二级集合及对应的原始样品编号。
3.1.2 吸取130mL样品，移入标记二级集合的离心管中；10份样品形成一个1300mL的二级集合样品，充分涡旋震荡混匀。
3.1.3 从5个二级集合管中分别吸取210mL样品，移入标记有一级集合的离心管中，形成由50份样品1050mL体积组成的一级集合样品，充分涡旋震荡混匀。
3.1.4 从每个一、二级集合管中吸取500mL集合样品，分装至另一相应标记的离心管，用超敏感核酸检测试剂进行检测。
3.1.5 制备阴性集合外部质控品：使用50份HIV抗体和核酸阴性样品，按上述步骤，分别集合成5个阴性二级集合外部质控品和1个一级集合外部质控品。
3.1.6 制备阳性集合外部质控品：从9份HIV抗体和核酸阴性样品和一份至少含有HIV RNA10c/ml阳性样品中，分别移取130mL加入离心管中，形成一个1300mL的阳性二级集合外部质控品。再分别从4个已制备好的阴性二级集合外部质控品和上述阳性二级集合外部质控品中，移取210mL至标记为一级阳性集合外部质控品的离心管中，形成一级阳性集合外部质控品。
3.1.7 一级和二级阴、阳性集合外部质控品分别用于RT-PCR中每一轮一级和二级集合样品的检测。
3.2 集合样品的检测和分解路线
使用商品化核酸检测试剂，应严格按照试剂说明书操作。按照各商品化核酸试剂集合PCR的方案进行检测，集合样品的数量根据各试剂方案操作。方法简述如下：
3.2.1 用HIV RNA RT-PCR超敏检测方法对一级集合样品进行检测，阳性反应的一级集合样品进入下一检测步骤。
3.2.2 用HIV RNA RT-PCR超敏检测方法对所有组成阳性一级集合的二级集合样品进行检测，阳性反应的二级集合样品进入下一检测步骤。
3.2.3 用HIV RNA RT-PCR标准检测方法检测所有组成阳性二级集合样品的的10份单个样品，确定核酸阳性的单个样品。 HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早期HIV感染诊断。尽管HIV RNA检测敏感性在感染早期较高（出生后1个月内），但是HIV DNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响早期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测。婴幼儿的抗体检测流程和结果判断见第二章（HIV抗体检测）。
4.1 适用范围
未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿；未满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染者。
4.2 检测程序及结果报告
4.2.1 于婴儿出生后6周（42天）采集第一份血样本（血样本可制备成DBS或EDTA抗凝全血），送检。
4.2.2 若第一份血样本检测呈阳性反应，尽快再次采集第二份血样本进行检测。若两份血样本检测均呈阳性反应，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性”，诊断儿童HIV感染。及时对HIV感染儿童进行追踪和病情监测，将其转介到儿童抗病毒治疗医疗服务机构，并为其提供机会性感染预防等服务措施；若第二份血样本检测呈阴性反应，待婴儿满3个月再次采集血样本进行检测。若第一份血样本检测呈阴性反应，继续提供儿童保健和随访服务，待婴儿满3个月再次采集血样本进行检测。
4.2.3 若婴儿满3个月再次检测呈阴性反应，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阴性”，按照未感染儿童处理，继续提供儿童保健随访服务；于儿童满12个月时，按照“HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程”（图4），开始HIV抗体检测，最终确定儿童感染状态。若婴儿满3个月再次检测呈阳性反应，尽快再次采集血样本进行检测。第三份血样本检测呈阳性反应，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性”；若第三份血样本检测呈阴性反应，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阴性”；分别按照前述流程提供相应服务。
4.2.4 不同时间“婴儿HIV感染早期诊断”检测均呈阴性反应的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6周和3个月（若6周时检测结果为阳性可尽快）再次采血进行核酸定性检测，进行早期诊断。儿童满18个月后则可直接进行抗体检测。
4.2.5 如果婴儿第一次采血时已满3个月，但未满12个月，则应尽快在不同时间采集两份血样本；同时将两份血样本送检，按照前述流程进行检测。如果儿童第一次采血时已满12个月，则应首先按照“艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程”（ 图4）进行HIV抗体检测。若两种不同原理或厂家生产的HIV抗体检测试剂检测结果均为阴性，则排除儿童感染；若HIV抗体检测试剂检测结果呈阳性反应，不能通过抗体检测确定儿童感染状态，则可在不同时间采集两份血样本，按照前述流程进行“婴儿HIV感染早期诊断”检测。如果儿童第一次采血时已满18个月，则应按照HIV抗体检测流程（图1）进行HIV抗体检测，无需进行“婴儿HIV感染早期诊断”检测。

㈣ pcr扩增产物分析的方法有免疫印迹吗

PCR扩增产物的分析方法微孔板夹心杂交法颜色互补分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打点杂交法微孔板夹心杂交法：该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。DNA的固定在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方 法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合 适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷 酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后， 终浓度为最适固定浓度）。用胶布封好，浸于37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。杂交可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。显色根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。颜色互补分析法(A)颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显着。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。 用PBS液漂洗。
扩增产物与包被板的结合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。 ELISA：向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍， 向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。于ELISA计数仪上450nm测定OD值。另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位 点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合 后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。需注 意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗 传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一 般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试 验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序 列。OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节 连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端 修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其 固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行 多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。 此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连 接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位 置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键 是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为 例的。如图2-6中的地高辛标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更 易于自动化。
寡核苷酸的设计与标记：用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于 即将连接的两个寡核苷酸接头的5’端。即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3’端。 左侧寡核苷酸是5’标记生物素。右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的 3’-OH相连接。用PNK酶处理很易使其5’或3’标记可以选择其它标记物（如荧光素 等）。OLA反应：向一软质圆底微滴定板内依次加入：3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连 接(约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释)。5X连接缓冲液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定最适 酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用 10min。将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器 上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。再用数毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。打点杂交当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性 均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或 法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的 方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。
膜的制备：点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每 一个探针制备1张膜。然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特 异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原 菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的 PCR产物作探针去杂交。这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列 变异的种类。显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后 一方法仅需一次杂交即可判断结果。产物的固定：⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的 大小裁剪膜，并做好标记。⑵将膜浸入水中湿透至少 1min。⑶变性PCR产物：此步可在圆底微孔板或微量离 心管内操作。每点的变性方法为；5～20μl(50～100ng)PCR 产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混匀，室温作用5min即可。⑷小心将预湿的膜装在点 样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。 因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融 合。膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真空泵。⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲 液，真空抽滤“洗涤”样品。⑹取下膜，置于厚3mm滤 纸上渍干。重复制备用于其它基因探针的膜时，一定要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。⑺渍干 的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的强度下照射使DNA固定在膜上。此时，的膜可直接用 于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。探针的固定：因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较 困难，即使固定上，也会影响杂交。这就是需要将寡 核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固 定。因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基共价结合，使探针间接地牢固地固定在尼龙膜上。这 种加尾固定的探针不影响杂交。但这种杂交对固定探针的要求是，在同一条件下与PCR产物的杂交必须是特 异的。通过选择探针的合适长度，G+C含量或通过改变 探针的固定可达到特异性的要求。这种固定的探针可 用于检测人类基因的突变，也可用来检测病原微生 物。
(1)加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端，在四种脱氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通过改变dT浓度和TdT量 可调节加尾长度，在下述反应条件下，加尾长度可达 400个dT。①向一微量离心管中依次加入：寡核苷酸探 针，100～200pmol;10×TdT缓冲液(1mol/L二甲胂酸钾; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；补水至100μl。 ②混匀后，稍加离心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA终止反应。加尾长度可通过10%聚 丙烯酰胺凝胶电泳监测。(2)点膜：①加尾探针6pmol，用0.3mol/LNaOH室温处理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等体 积6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三 钠pH7.0)。③将6×SSC预湿的尼龙膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在点样器上。④点样方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的4～6 滤纸上，DNA面朝上。②将滤纸和膜一起置于254nmUV 灯下照射固定，poly(dT)400尾的探针在40mJ/cm2r的 剂下固定效果最好。辐射剂与给定光源对给定面积的 能量释放率（辐照度）和辐照时间有关。一般对一个 固定光源而言，辐照剂量为：辐照剂量（J/cm2）=辐照度（w/m2）×辐照时间(s)其中，J为辐照能量单位；w为辐照通量单位。辐照度 与照射角度有关，与入射角度θ的余弦（cosθ）呈正 相关。③固定后，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中于42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于杂交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室温保存。
探针的固定量与加尾长度均影响杂交结果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探针与等PCR产物（2.33fmol） 杂交，固定6pmol苷酸杂交时，有29.2%的PCR产物与 1.1%的寡核而固定的探针600fmol杂交时，仅有2.2%的产 物与0.8%。用不同加尾长度的等量产物6pmol固定寡核苷酸与（时，仅0.33%233fmol）杂交结果表明， poly(dT)300探针与产物杂交；而有1.3%的探针poly (dT)400时，则与产物杂交。因此，固定的探针加最好 在400个以dT尾上，固定量也至少6pmol。杂交寡核苷酸探针的杂交：每一寡核苷酸探针均有自己的杂交温度和漂 洗条件，主要取决于探针的Tm值。Tm值则受探针长度，G+C含量和杂 交液的盐渡影响。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)来计算Tm 值。在1mol/L盐浓时，杂交温度可比预测的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高杂交温度和降低盐浓度可提高杂交的严格性。漂洗液一般不含 盐，漂洗温度比杂交温度低5℃。一旦确定了探针的杂交与漂洗条 件，可按下述方法进行杂交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中预湿点样膜。⑵置 膜于塑料封口袋中，并加入适量杂交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋内不要有气泡。⑶置于水浴加热摇 动，在杂交温度下预杂交5min。⑷取出塑料袋，剪开一角。加入非 放射性标记物（如生物素-补骨脂素）标记的探针。每毫升杂交中加 入1pmol探针。封口后摇育20～60min。杂交时间不能太长，否则会 引起探针与膜的不可逆结合。⑸从袋中取出膜，室温下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗温度下预热的漂洗 液在合适温度下洗10min。漂洗后的膜可用于显色检测。
反向点杂交：反向点杂交即扩增产物作为相中的探针与固定到膜上 的寡核苷酸杂交。如前述，这种杂交最基本的要求就是在同一条件 下，所有固定探针均与扩增产物特异杂较。为此，主要是认真选择 与设计寡核苷酸探针，使各探针在同一条件下Tm值相近。在同一杂 交特异。一旦确定了合适的杂交和漂洗条件，即可按上述基本程度杂交。只是杂交探针（产物）在加入前应加热变性或用等体积的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA变性。杂交时间（2～4h）要长些。PCR 产物的标记可以用标记引物扩增或在扩增时掺入标记物。杂交的检测不同非放射性标记物的检测原则上基本相同。若为酶标探针则可直接进行显色检测。下面以生物素标记物为例加以说明。酶标亲和素的结合 ⑴漂洗后的膜在缓冲液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中与一定浓度的HRP-标记链霉亲和素在室温作用10min，并轻轻振 荡。⑵用缓冲液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室温下漂 洗5min，并轻轻振荡，将膜上非特异吸附的HRP-链霉亲和素洗掉。显色不同酶标亲和素的显色条件与底物均不同，下面以HRP的显色加以说 明。⑴将上述膜于缓冲液C（100mmol/L柠檬酸钠，pH5.0）中在室温下作 用5min，并轻轻振荡。⑵在缓冲液D中室温下，轻轻振荡10min。此步应避强光。缓冲液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用无水乙醇配制）和19份缓冲液C。⑶在缓冲液E中显色，该液应现用现配。应避强光。缓冲液E：2000 份缓冲液D和1份3%H2O2。显色时间取决于杂交体中含标记物的量； 一般为1～15min即可。杂交阳性呈深蓝紫色。⑷当膜色（信/噪比）合适时，在液C中洗膜1h终止反应，在此过程 中应更换2～3次液体。⑸杂交膜可拍照记录结果，也可封于缓冲液C避光条件下贮存。膜的再利用⑴脱色：将膜置于0.18%Na2SO4液中即可脱掉膜上的颜色。 ⑵去杂交的探针：将膜置于水-0.5%SDS中，65℃加热1h。 ⑶这种处理的膜可再与另一种探针杂交。
问题与对策信号弱：①点膜的产物少-增加点膜量；②杂交时探针浓度低-加大 探针浓度；③杂交漂洗过于严格-增加盐浓度或降低杂交温度；④TMB 液贮存时间过长（TMB液4℃可存2个月）-重新配制。本底信号强：①杂交时探针浓度高-降低探针浓度；②杂交时间长- 缩短杂交时间；③杂交漂洗不严格-降低盐浓度和提高杂交温度；④ 显色时间长-缩短显色时间。杂交膜的高本底着色：①同②；②在缓冲液C中洗膜时间短-延长漂 洗时间（过多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底着色；③同2④；④避 光不严格-显色过程中及显色后要确保杂交膜的避光。阴性对照出现阳性信号：①点样混淆，即把阳性标本点于阴性对照 的位置，重复实验即可纠正；②PCR较物的残留污染，用新配的试剂 重复全部扩增反应。（我自己加进的：Hybond—N+：Hybond-N+是带正电尼龙膜，对在碱性条件下杂交和普通的Southern杂交均有很好的灵敏性，故核酸样品可通过简单的碱处理固定在膜上，而不必在紫外灯下固定，尽管紫外固定的重复性最好。）
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PCR扩增产物的分析方法
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PCR扩增产物的分析方法
微孔板夹心杂交法
颜色互补分析法
PCR-ELISA法
PCR-OLA法
PCR-打点杂交法
微孔板夹心杂交法：
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的

㈤ 微生物的传统检测方法有哪些

传统检测有三种方法

1、直接显微镜观察，正常情况，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度以及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。

2、选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件，选择培养基，其作用是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用类型或某一特征进行间接判断，得到的微生物往往并不只有一种，但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。

3、鉴别培养基，根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。与选择培养相比，鉴别培养基的鉴别所得结果的范围比较小，一般可直接测定某微生物的种类。

㈥ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

㈦ 微生物生长的几种检测方法

一、生长量测定法

1.1体积测量法：又称测菌丝浓度法。

通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

1.2称干重法：

可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

1.3比浊法：

微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。

1.4菌丝长度测量法：

对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长

二、微生物计数法

2.1血球计数板法:

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2染色计数法：

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

2.3比例计数法：

将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4液体稀释法：

对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（mostprobablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5平板菌落计数法：

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定

体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

2.6试剂纸法：

在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7膜过滤法：

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

2.8生理指标法：

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的'生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。

2.9测定含氮量：

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

2.10测定含碳量：

将少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

2.11还原糖测定法：

还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生(转载于:mHg）的条件下才能生长，他们有完整的呼吸链，以分子氧为最终氢受体，具有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。

兼性厌氧菌:它是以在有氧条件下的生长为主也可兼在厌氧条件下生长的微生物，有时也称“兼性好氧菌”。

微好氧菌:只能在娇滴滴额氧分压（1.33~3.Pa，正常大气中的氧分压为0.2bar）下才能正常生长的微生物。

耐氧菌:耐氧性厌氧菌的简称，是一类可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌。

厌氧菌:有一般厌氧菌与严格厌氧菌（专性厌氧菌）之分。

超氧阴离子自由基:活性氧的形式之一，因有奇数电子，故带负电荷；它既有分子性质，又有离子性质；其性质极不稳定，化学反应力极强，在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构，还可形成其他活性氧化物，故对生物体极其有害。

超氧化物歧化酶(SOD):保护好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金属辅基的不同分三类：1、含Cu、Zn的SOD，存在于几乎所有真核生物的细胞质中；2、含Fe的SOD，主要存在原核生物中；3、含Mn的SOD，主要存在于真核生物的线粒体中。SOD除可清除超氧阴离子自由基外，还发现在防治人体衰老、治疗自身免疫性疾病、抗癌、防白内障、治疗放射病和肺气肿以及解除苯中毒等方面有一系列疗效。

PRAS培养基:用严格厌氧方法配置、分装、灭菌后的厌氧菌培养基，称为预还原无氧灭菌培养基，即PRAS培养基。

厌氧罐:培养厌氧菌的装置。

亨盖特滚管技术:一种集制备高纯氮、以氮驱氧和全过程实现无氧操作、无氧培养、无氧检测于一体，用于研究严格厌氧菌的技术和装置。

厌氧手套箱:一种用于无氧操作和培养严格厌氧菌的箱形密闭装置。

摇瓶培养:一般将三角瓶内培养液的瓶口用8层纱布包扎，以利通气和防止杂菌污染，同时减少瓶内装液量，把它放在往复式或旋转式摇床上作有节奏的震荡，以达到提高溶氧量的目的。

曲:是一类用麸皮、米糠等疏松的固体营养料接种、培养微生物而制成的含氧活菌产品。

曲法培养:将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后，薄薄地铺在培养容器表面，使微生物即可获得充足的氧气，又有利于散发热量，对真菌来说，还有利于产生大量孢子。

通风曲:一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业中广泛应用。

污染:有害微生物通过气流、水流、接触和人工接种等方式，传播到合适的基质或生物对象上而造成种种危害。

巴氏消毒法:有发过微生物学家巴斯德用于果酒消毒，故名。这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的也太风味食品或调料的低温消毒方法（一般在60-85度下处理30min至15s）。有两种方法：1、低温维持法；2、高温瞬时法。

间歇灭菌法:适用于不耐热的培养基灭菌。方法是：讲带灭菌的培养基放在80-100度下蒸煮15-60min，以杀灭其中所有的微生物营养体，然后放至室温37度下保温过

夜，诱使其中残存的芽孢发芽，第二天再以同样方法蒸煮和保温过夜，如此重复3天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的效果。

连续加压蒸气灭菌法:让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。

梅拉特反应:高温灭菌时，培养基中得氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质）的游离氨基与羧基化合物（糖类）的羰基间发生复杂的化学反应，导致培养基褐变同时，还降低了有关营养物成分，故应设法避免。

石炭酸系数:一定时期内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效果的石炭酸的最高稀释度之比。

抗生素:一类有微生物或其他生物生命活动过程中合成的此生代谢产物或其人工衍生物，他们在很低浓度时就能一直或干扰他种生物的生命活力，因而可用作有两的化学治疗剂。

抗代谢药物:一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。3种作用：1、与正常代谢物一起共同竞争酶的活性中心，从而使微生物正常代谢所需要的重要物质无法正常合成，例如磺胺类；2、“假冒”正常代谢物，使微生物合成出无法正常生理活动的假产物，如8-重氮鸟嘌呤取代鸟嘌呤而合成的核苷酸就会产生无正常功能的RNA；3、某些抗代谢药物与某一生化合成途径的终产物结构类似，可通过反馈调节破坏正常代谢调节机制，例如，6-巯基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。

选择毒力:大于病原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。