葡萄糖浆蛋白质检测方法

① 怎样检测生物组织中的糖类，脂肪和蛋白质

糖类中还原糖(例葡萄糖、果糖、麦芽糖等)可用斐林试剂检测。先准备组织样液，再准备0·1g/ml的氢氧化钠溶液、0.05g/ml硫酸铜溶液。方法步骤:1.(1)取2ml组织样液加入1支洁净的试管。
(2)再另取2支试管，分别加入2mlNaOH与硫酸铜溶液，再把硫酸铜溶液倒入氢氧化钠溶液的试管，振荡混合均匀，即为斐林试剂。
(3)把新配制的斐林试剂与组织样液,等体积混合，振荡摇匀，然后放入50~60度水浴中保温，观察颜色变化。如出现砖红色沉淀，即说明有还原糖。
非还原糖(淀粉用碘液检测即可)碘遇淀粉变蓝。
脂肪用苏丹三或苏丹四检测，材料可用浸泡过"的花生种子，先制成临时装片，再用显微镜观察。或者把试剂滴加到组织样液中，观察颜色变化。
临时装片制作:用刀片先在花子叶切开，然后做徒手切片，放在清水中，然后用毛笔蘸取最薄的一片放在载玻片中央，滴加苏丹三溶液染色3到5分钟，用吸水纸吸取多余染液，再用体积分数为50%酒精洗去浮色，盖上盖玻片。放在显微镜下观察。脂肪粒被苏丹三染成橘黄色、苏丹四染成红色。(上述徒手切片做不好，可在花生子叶上
刮取少量粉末，直接涂在载玻片上来替代。

蛋白质用双缩脲试剂来检测。双缩脲是由A液(0.1g/ml的氢氧化钠)、B液(O.01g/mL的硫酸铜溶液组成。)
使用时取组织样液(用蛋清稀释液或豆浆)一2mL加入洁净试管，然后先滴加1mLA液，振荡试管摇匀，再滴加3~4滴硫酸铜溶液，摇匀。蛋白质遇双缩脲生成紫色。

② 蛋白质浓度测定方法

蛋白质浓度测定方法：UV法，BCA法，考马斯亮蓝法等。

3、考马斯亮蓝法。

考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

③ 蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定分析方法有：马斯亮蓝法（Bradford）、Folin酚试剂法（Lowry）、BCA法等。
蛋白纯化是目前生物研究邻域中较为热门的一个大方向，其中蛋白含量测定是纯化过程中很重要的一项内容。
Folin酚试剂法（Lowry）是目前最灵敏的测定方法，但耗费时间长，操作需严格计时，颜色深浅随不同蛋白质而变化，因为其中的酒石酸钾-硫酸铜试剂配置保存困难，逐渐被考马斯亮蓝法取代。
考马斯亮蓝法（Bradford）是采用考马斯亮蓝G250染料与蛋白质结合，应用广泛，颜色稳定，专一性较差，干扰物质多。
BCA法主要基于双缩脲原理，用于快速检测，抗干扰能力强，但受金属螯合剂影响。
每种测定方法都不是完美无缺的，都有其优缺点，在选择时应考虑：试验所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定时所耗费的时间等因素。就具体情况选择最合适的试验方法。

④ 蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的十种测定方法如下：

三、双缩脲法：

实验原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

四、BCA法：

实验原理：BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。

二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

五、Lowry法：

实验原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

六、考马斯亮蓝法：

实验原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

七、凯氏定氮法：

实验原理：凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。

但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。

八、Lowry法测定试剂盒：

Folin酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。定量范围为5～100μg/ml蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

九、BCA法测定试剂盒：

碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。

实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。

十、分光光度计法。

1、取八支（或者更多）干净的10ml离心管，标记上号。

2、取100ulBSA，加PBS2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml。

3、5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取10ml5×G250染色液，加入40ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

4、按下表加入试剂（以每孔5ml计，多余的用来清洗比色皿）。

⑤ 如何检测生物组织中的糖类，脂肪，和蛋白质

一．实验目的：尝试用化学试剂检测生物组织中糖类、脂肪和蛋白质
二．实验原理：某些化学试剂能使生物组织中的有关有机化合物,产生特定的颜色反应.
1．可溶性还原糖（如葡萄糖、果糖、麦芽糖）与斐林试剂发生作用,可生成砖红色的Cu 2O沉淀.即Cu ( OH ) 2被还原成Cu 2O,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸.
2．脂肪可以被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色（或被苏丹Ⅳ染液染成红色）.
3．蛋白质与双缩脲试剂发生作用,产生紫色反应.（蛋白质分子中含有很多肽键,在碱性NaOH溶液中能与双缩脲试剂中的Cu2+作用,产生紫色反应.）
4.淀粉遇碘变蓝色.
三．实验材料
1．做可溶性还原性糖鉴定实验,应选含糖高,颜色为白色的植物组织,如苹果、梨.（因为组织的颜色较浅,易于观察.）
2．做脂肪的鉴定实验.应选富含脂肪的种子,以花生种子为最好,实验前一般要浸泡3-4小时（也可用蓖麻种子）.
3．做蛋白质的鉴定实验,可用富含蛋白质的黄豆或鸡蛋清.
四、实验试剂
斐林试剂（包括甲液：质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和乙液：质量浓度为0.05g/ mL CuSO4溶液）、苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液、双缩脲试剂（包括A液：质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和B液：质量浓度为0.01g/ mL CuSO4溶液）、体积分数为50%的酒精溶液,碘液、蒸馏水.
五、方法步骤：
（一） 可溶性糖的鉴定
1.制备组织样液.
苹果或梨组织液必须临时制备，因苹果多酚氧化酶含量高,组织液很易被氧化成褐色,将产生的颜色掩盖.
2.注入2mL组织样液.
3.注入1mL新制的斐林试剂,振荡.
（现配现用、先混后加）
应将组成斐林试剂的甲液、乙液分别配制、储存,使用前才将甲、
乙液等量混匀成斐林试剂；切勿将甲液、乙液分别加入苹果组织样液中进行检测.
斐林试剂很不稳定,甲、乙液混合保存时,生成的Cu ( OH ) 2在70-900C下分解成黑色CuO和水；甲、乙液分别加入时可能会与组织样液发生反应,无
Cu ( OH ) 2生成.
4.水浴加热：试管放在盛有50-650C温水的大烧杯中,加热约2分钟,观察到溶液颜色：浅蓝色 → 棕色 → 砖红色（沉淀）
最好用试管夹夹住试管上部,使试管底部不触及烧杯底部,试管口不朝向实验者.
也可用酒精灯对试管直接加热.
防止试管内的溶液冲出试管,造成烫伤；
缩短实验时间.
（二）脂肪的鉴定
取材、切片、制片：花生种子浸泡、去皮、切下一些子叶薄片,将薄片放在载玻片的水滴中,用吸水纸吸去装片中的水.

干种子要浸泡3-4小时,新花生的浸泡时间可缩短.
浸泡时间短,不易切片,浸泡时间过长,组织较软,切下的薄片不易成形.切片要尽可能薄些,便于观察.
染色：在子叶薄片上滴2-3滴苏丹Ⅲ（染色3分钟）或苏丹Ⅳ染液（染色1分钟）.
染色时间不宜过长.
漂洗：用吸水纸吸去薄片周围染液,用50%酒精洗去浮色,吸去酒精.
酒精用于洗去浮色,不洗去浮色,会影响对橘黄色脂肪滴的观察.同时,酒精是脂溶性溶剂,可将花生细胞中的脂肪颗粒溶解成油滴.
用吸水纸吸去薄片周围酒精,滴上1-2滴蒸馏水,盖上盖玻片.
滴上清水可防止盖盖玻片时产生气泡.
镜检：先低后高（高倍镜用法：移物换器时针反）,低倍镜下找到花生子叶薄片的最薄处,可看到细胞中有染成橘黄色或红色圆形小颗粒.
装片不宜久放.
时间一长,油滴会溶解在乙醇中.
三、蛋白质的鉴定
制备组织样液.（浸泡、去皮研磨、过滤.）黄豆浸泡1至2天,容易研磨成浆,也可购新鲜豆浆以节约实验时间.加样液约2ml于试管中,加入双缩脲试剂A,摇匀；再加入双缩脲试剂B液3-4滴,摇匀,溶液变紫色.
A液和B液也要分开配制,储存.鉴定时先加A液后加B液.
CuSO4溶液不能多加.
先加NaOH溶液,为Cu2+与蛋白质反应提
供一个碱性的环境.A、B液混装或同时加入,会导致Cu2+变成Cu ( OH ) 2沉淀,而失效.
否则CuSO4蓝色会遮盖反应的真实颜色.可用蛋清代替豆浆.蛋清要先稀释.
如果稀释不够,在实验中蛋清粘在试管壁,与双缩脲试剂反应后会粘固在试管内壁上,使反应不容易彻底,并且试管也不易洗干净.
附：淀粉的检测和观察用试管取2ml待测组织样液,向试管内滴加2滴碘液,观察颜色变化.碘液不要滴太多，以免影响颜色观察