核酸杂交检测方法

Ⅰ 核酸检验方法

核酸检测具体流程如下：
1. 核酸提取
使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
2. 逆转录合成cDNA
逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。
3. PCR扩增反应（使用二次扩增的套式PCR扩增方法）
PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板（DNA或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。
4. 扩增产物定性分析
扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。
5.结果判定和完成报告单
（1）实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。
（2）HIV核酸检测阳性：发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。
（3）HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。
（4）应在完成检测后5个工作日内发出检测报告。

Ⅱ 分子杂交技术的核酸探针标记法

核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
材料： 待标记的DNA。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步骤:
(1) 按下列配比混合:
未标记的dNTP 10μl
10×切口平移缓冲液 5μl
待标记的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA聚合酶 4单位
DAN酶 I 1μl
加水至终体积 50μl
(2) 置于15℃水浴60分钟。
(3) 加入5μl EDTA终止反应。
(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
[注意]
1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
材料：待标记的DNA片段。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。
(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。
操作步骤:
(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。
(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未标记的dNTP溶液 1μl
10×随机标记缓冲液 1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。
(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。
(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。
[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。
2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。 用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。
1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)10×Klenow缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
(2)0.1mol/L DTT溶液。
(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。
(6) Klenow片段（5单位/ml）。
(7)适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
操作步骤：
(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：
单链模板（约0.5pmol） 1mg
适当引物 5pmol
10×Klenow缓冲液 3ml
加水至 20ml
(2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[a-32P]dATP 5ml
未标记的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml
混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
(4)加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。
(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。
(6)68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。
(7)加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小时。
(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。
(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。
2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料：已提纯的RNA或mRNA
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反转录酶(200000单位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
(6)250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40单位/ml)。
操作步骤:
(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：
RNA或mRNA 10.0ml
合适的产物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至 48ml
反转录酶(200000单位/ml) 2ml
混匀后,稍稍离心，37℃保温2小时。
(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30分钟以水解RNA。
(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。 现以Klenow片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。
1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。
2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。
3、试剂：
(1)3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。
(2)合适的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow片段(5U/ml)。
(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。
4、操作步骤：
(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。
(2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml
(3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。
(5)70℃加热5分钟,终止反应。
(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。
[注意]
1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。
2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。
3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。 利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。
1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。
3、试剂：
(1)10×T4多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4多核苷酸激酶（10单位/ml）。
4、操作步骤：
(1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5分钟，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列试剂：
10×激酶缓冲液 5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4多核苷酸激酶 2ml
加水至 50ml
混匀后置37℃水浴20分钟。
(3)再加入20单位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50柱层析。
此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。
除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。 许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。
噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。 用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。并且用来合成RNA的模板能转录多次，可获得比单链DNA更高产量的RNA。
反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。
另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。

Ⅲ 请教DNA杂交实验方法

杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroplex）。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。使双螺旋解开成为单链，因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

Ⅳ 几种核酸杂交技术的比较 点杂交实验原理、步骤

并介绍了点杂交的基本概念及实验原理、方法。
�0�2几种核酸杂交技术的比较�0�2 点杂交实验原理、步骤
（1）几种核酸杂交的异同点
核酸杂交是分子生物学的基本技术，也是遗传学研究和基因诊断的常用方法。核酸杂交的形式有多种，其中最常用的是Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、点杂交等。虽然形式多样，但都是基于核酸分子的碱基互补原理。从杂交材料来看，杂交分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。从杂交分子状态来看，杂交分为液相-固相杂交和液相-液相杂交。
上述几种杂交都属于液相-固相杂交，即将参与杂交的一方分子固定在固相的支持载体上，另一方分子以液相形式参与杂交。参与杂交的双方分子必有一方被标记，以便产生能够被检出的杂交信号;在液相-固相杂交中往往液相分子被标记，这样才能产生有意义的差别信号。在杂交在中，被标记的分子称为探针，而与探针进行杂交的分子称为被检测样品(被检分子)。大多数液相-固相杂交中被检样品往往是混合分子，如提取的基因组DNA或某种组织的RNA，并且将被检样品固定在载体上，而探针往往是单一分子，如某一基因的片断。杂交结果是根据信号的强弱和位置进行判断，如被检分子的分子量(或长度)，被检分子的表达强度等。这种杂交适用于相同基因片断对不同样品的检测。若进行一种样品被不同基因片断的检测时，就必须采取反向的方式，即将不同的基因片断固定在载体上，而将被检样品制成液相并进行标记。这种反向的方式称为反向杂交，反向杂交中被标记的样品也可以称为探针。
在液相-固相杂交中固相载体往往采用尼龙膜或醋酸纤维膜，这些经过特殊处理的材料对核酸分子具有强大的吸附力，在操作中不易脱落。探针标记往往采用放射性标记，如32P、35S等，由于放射性物质的危害性，现在非放射性标记也在广泛使用，如生物素标记、地高辛标记等。一般来说，放射性标记适用于Southern杂交、Northern杂交和点杂交，非放射性标记适用于原位杂交。放射性标记灵敏度高，线形范围宽，非放射性标记定位性强，没有衰变，危害小。
（2）点杂交的概念
点杂交(dot blot)是杂交信号呈现斑点样的杂交方法，在操作上是把参与杂交的一方分子点样到膜上。由于杂交分子预先没有进行像Southern杂交和Northern杂交之前的电泳分离，也没有像原位杂交那样，杂交一方的分子已经表现出组织细胞分布的位置特异性，所以点杂交的结果判断完全视杂交信号的强弱，其信息量没有其它杂交形式的信息量丰富。但点杂交的操作比较简单、结果直观、适用于大批样品的检测，因此它在许多方面也得到了广泛的应用。
一、实验目的
理解核酸杂交原理;熟悉核酸杂交的一般方法，掌握膜斑点杂交技术和结果分析。
二、实验原理
点杂交是核酸杂交中比较简单的一种技术，本质上也是单链核酸分子通过碱基互补而形成双链核酸的过程，当某单链分子被标记后，就可以检测与其互补的分子。
(一)印迹印迹(blot)就是将杂交一方的分子固定在膜上，对于Southern杂交和Northern杂交，往往采用毛细转移，真空转移或电转移等方法，使电泳分离的核酸分子“原位印迹”到膜上去，而点杂交则可采取人工点样的方法，将核酸分子固定到膜上去。在点膜时还要借助其它使核酸分子固定的方法(如点膜器、真空抽气装置)使分子更紧密地结合在膜上，并且不扩散。点杂交的印迹过程提供了一个固化平台和阵列，使杂交在已知位置上进行。
(二)标记标记(labeling)就是使参与杂交的一方分子带有可识别的物质，使杂交后显示信号。常用标记物有放射性同位素和非放射性物质，标记方法有随机引物标记法、缺口平移法和末端标记法等。在液相-固相杂交中，标记往往在液相分子上，使探针成为流动相。标记效率是影响杂交的重要因素，在一定范围内，比活性(可以理解为单位分子中的标记物数量与活性)越高越好。在杂交中，探针往往是过量的(杂交信号的强弱反映的是被检样品的量和基因丰度)，所以依靠增加探针量来提高杂交灵敏度的做法很有限的，应该提高探针的比活性。