A. 苯丙酮尿症
苯丙酮尿症，又称苯酮尿症（phenylketonuria，缩写为PKU）是一种可遗传的氨基酸代谢缺陷，影响患者的大脑发育，引起智力障碍和癫痫，并使患者出现皮肤白化、头发变黄、尿液有鼠臭味等症状。
苯丙酮尿症的症状
患儿在新生儿期和婴儿早期多无任何异常，症状随生长发育逐渐出现，并且多为不可逆转的脑损伤。通常在3-6个月时始初现症状。1岁时症状明显。患儿主要表现为智力障碍、毛发变黄、皮肤色白及四肢短小，同时身上有一种特殊的霉臭气，尿有一种鼠臭味，有时有癫痫发作。
1、出现喂养困难、呕吐、表情呆滞、烦躁不安和易激惹等症状，
2、头围较小，在出生时头发尚黑，生后数月因黑色素合成不足，头发由黑色逐渐变为棕色或黄色，虹膜颜色变浅;
3、皮肤逐渐变白，多数患儿面部长出湿疹样皮疹;
4、尿及汗液有特殊的霉味或鼠尿样臭味;
5、生后3个月表现生长发育落后和智力低下，逐渐加重，半数以上病例IQ68。年长儿约60%有严重的智能障碍。
6、2/3患儿有轻微的神经系统体征，如肌张力增高、腱反射亢进、小头畸形等，严重者可有脑性瘫痪。约1/4患儿有癫痫发作，常在18个月以前出现，可表现为婴儿痉挛性发作、点头样发作或其他形式。
7、大多数有烦躁，抑郁等精神症状，情绪不安、精神紧张、兴奋、易激惹、呈痴呆样面容。可出现一些行为、性格的异常，如忧郁、多动、自卑、孤僻等。
苯丙酮尿症的病因
1、苯丙酮尿症由什么原因引起的?
苯丙酮尿症是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积并从尿中大量排出。由于酶的丢失或缺陷，苯丙酮尿症患儿不能完全代谢苯丙氨酸蛋白，而该蛋白几乎在所有食物中都存在。如果不加治疗，苯丙氨酸就会堆积在患病新生儿血液中并引起大脑损伤和精神发育迟缓。
2、苯丙酮尿症如何影响患儿?
苯丙酮尿症患儿在出生后头几个月表现都可以是正常的。如果不加治疗，3到6个月时他们就开始对周围的环境不感兴趣，到1岁时，他们的发育就明显迟缓。那些未经治疗、中枢神经已经受损的苯丙酮尿症患儿常常易怒、焦躁不安并具有破坏性。他们躯体发育可以较好，头发常比其兄弟姐妹的要黄。
3、哪些人易患苯丙酮尿症?
当父母双方都带有苯丙酮尿症基因并且都将其传递给子女时，他们的子女就会遗传上苯丙酮尿症。如果父亲或母亲有苯丙酮尿症基因但不发病的，就称为携带者”。在携带者的每一个细胞中既有一个正常基因也有一个苯丙酮尿症基因。携带者没有任何健康影响。
当父母双方都是携带者时，他们就有1/4(25%)几率把苯丙酮尿症基因传递给子女，并导致子女一出生就患上苯丙酮尿症;子女从父母一方遗传苯丙酮尿症基因，而从另一方遗传正常基因的几率是2/4(50-50)，这使得子女也成为一个和自己父母一样的携带者;此外还有1/4的几率是父母传递的都是正常基因，则其子女既不会患病也不是携带者，完全正常。记住，这些几率对于每一次妊娠都是一样的。
苯丙酮尿症的治疗
苯丙酮尿症是一种代谢性遗传性疾病。如果不加治疗，会引起智力迟钝。幸运的是，目前通过常规的新生儿筛查，几乎所有的患病新生儿都可以被早期诊断并加以治疗，确保智力发育正常。
1、新生儿苯丙酮尿症筛查如何做?
用针扎婴儿的足后跟并采几滴血(同样的血样标本可以被用于许多其它先天性代谢性疾病的筛查)，血样常被送到当地的医学实验室进行检测，以便检测出血液中苯丙氨酸含量是否高出正常值。如果结果不正常，那么将做更多的检查去确定该婴儿是否患有苯丙酮尿症，或是其它因素影响了苯丙氨酸水平。
这种检查在婴儿生后24小时到7天内做，其精确度较高。然而，早期出院现象越来越普遍，许多婴儿在生后24小时之内就被检查。因为早期做这种检测，有些苯丙酮尿症可能被漏掉，因此美国儿科学会建议：生后24小时内做过检查的婴儿应该在生后1周到2周再次被检测。
2、苯丙酮尿症的症状可以防治吗?
可以。如果在出生后7到10天就开始用低苯丙氨酸饮食治疗患病婴儿，其精神发育迟缓就可以避免。
刚开始，用含有蛋白质但不含苯丙氨酸的特殊配方奶粉喂养病婴。母乳或婴儿配方奶粉被少量喂养以便只提供婴儿可耐受的苯丙氨酸量。随后，一些蔬菜、水果、谷类产品(如麦片和面条)及其它低苯丙氨酸食品可以加入饮食中，但是不能喂养普通牛奶、奶酪、鸡蛋、肉类、鱼类和其它高蛋白食品。蛋白质是人体正常生长发育所必需的，所以儿童必须连续吃含有高蛋白质和必需营养素但只含少量或不含苯丙氨酸的特殊配方奶粉。加有人工甜品(天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯)的饮料和食品也必须尽量避免。
擅长治疗苯丙酮尿症的医学中心应对患有苯丙酮尿症的儿童和成人进行跟踪随访。每一病人的饮食必须个体化，需根据其苯丙氨酸耐受量、年龄、体重和其它因素而定。所有病人需定期做血液检测以测定其苯丙氨酸含量是否过高或过低。一岁以内的婴儿可以1周1次，整个儿童期可以1月1次或2次。饮食必须根据检测结果做相应调整。
苯丙酮尿症患者必须在整个儿童和青少年时期、并且一般是终生食用低苯丙氨酸饮食(尽管患者成年以后，有时可以不食用这种受限饮食)。直到20世纪80年代，医生认为：大约在6岁左右，大脑已经发育成熟，这时苯丙酮尿症患儿可以安全地中断他们的特殊饮食。不过，大多数患儿如果在儿童和青少年时期其血中苯丙氨酸水平过高，就会导致智力降低、学习力下降和行为异常。
苯丙酮尿症患儿的父母和患病成人应该和苯丙酮尿症专科门诊的医生们一起讨论他们的饮食和治疗问题。
苯丙酮尿症的检查
1、新生儿筛查：在刚出生经哺乳后72小时由新生儿的足跟部针刺取血，送至筛查实验室。其苯丙氨酸浓度可以采用Guthrie细菌生长抑制试验半定量测定;亦可在苯丙氨酸脱氢酶作用下进行比色定量测定，后者的假阴性率较低。如超过4毫克/分升时，就要复查采静脉血测定血苯丙酮尿浓度，如超过20毫克/分升时，即可诊断为苯丙酮尿症。
2、化学呈色法检测：对疑似本病的年长儿，可用化学呈色法检测其尿中的苯丙酮酸
(1)、三氯化铁(FeCl3)试验：在新鲜尿液5ml加入0.5ml的FeCl3，尿呈绿色为阳性。
(2)、2,4-二硝基苯肼试验：在1ml尿液中加入1ml的DNPH试剂，尿液呈黄色荧光反应为阳性。
这两种试验阳性反应也可见于枫糖尿症，胱氨酸血症，故并非为PKU特异性试验，需进一步做血苯丙氨酸测定才能确诊。由于其特异性欠佳，有假阳性和假阴性的可能，一般用作对较大儿童的初筛。
3.、血苯丙氨酸测定 有两种方法：
(1)、Guthrie细菌抑制法：正常浓度L(2mg/dl)，PKU>1200μmol/L。
(2)、苯丙氨酸荧光定量法：正常值同细菌抑制法。
4、苯丙氨酸负荷试验 对血苯丙氨酸浓度大于正常浓度，L者口服苯丙氨酸100mg/kg，服前、服后1，2，3，4h分别测定血苯丙氨酸浓度。血苯丙氨酸>1200μmol/L诊断为PKU，<1200μmol/L，为高苯丙氨酸血症。
5、血浆游离氨基酸分析和尿液有机酸分析血浆和尿液的氨基酸、有机酸分析不仅为本病提供生化诊断依据，同时也可鉴别其他可能的氨基酸、有机酸代谢缺陷。可选用的方法有氨基酸自动分析仪、气相层析(GC)、高压液相层析(HPLC)或气-质联用等(GC-MS)。
6、HPLC尿蝶呤图谱分析 10ml晨尿加入0.2g维生素C，酸化尿液后使8cm×10cm新生儿筛查滤纸浸湿，晾干，寄送有条件的实验室分析尿蝶呤图谱，进行四氢生物蝶呤缺乏症的诊断和鉴别诊断。应用高压液相层析(HPLC)测定尿液中新蝶呤和生物蝶呤的含量，可以鉴别各型PKU：PAH缺乏的患儿尿中蝶呤总排出量增高，新蝶呤与生物蝶呤比值正常;DHPR缺乏患儿呈现蝶呤总排出量增加，四氢生物蝶呤减少;6-PTS缺乏患儿则呈现新蝶呤与生物蝶呤比值增高，新蝶呤排出量增加;GTPCH缺乏患儿呈现蝶呤总排出量减少。
7、口服四氢生物蝶呤负荷试验 在血Phe浓度>600μmol/L情况下，直接给予口服BH4片20mg/kg，BH4服前，服后2，4，6，8，24h分别取血作Phe测定。对于血Phe浓度<600μmol/L者，可作Phe+BH4联合负荷试验，即给患儿先口服Phe(100mg/kg)，服后3h再口服BH4，服Phe前、后1，2，3h，服BH4后2，4，6，8，24h分别采血测Phe浓度。BH4缺乏者，当给予BH4后，因其苯丙氨酸羟化酶活性恢复，血Phe明显下降，PTPS缺乏者，血Phe浓度在服用BH4后4～6h下降至正常;DHPR缺乏者，血Phe浓度一般在服BH4后8h或以后下降至正常;经典型PKU患者因苯丙氨酸羟化酶缺乏，血Phe浓度无明显变化。
8、脑电图 约80%病儿有脑电图异常，可表现为高峰节律紊乱、灶性棘波等。
9、CT和MRI检查 患者头颅CT或磁共振影像(MRI)可无异常发现，也可发现有不同程度脑发育不良，表现为脑皮质萎缩和脑白质脱髓鞘病变，后者在MRI的T1加权图像上可显示脑室三角区周围脑组织条形或斑片状高信号区。
10、智力测定 评估智能发育程度。
11、DNA分析目前对PAH和DHPR缺陷可用DNA分析方法进行基因诊断。但由于基因的多态性众多，分析结果务须谨慎。
12、酶学分析：PAH仅存在于肝细胞中，取材检测其活性比较困难;其他3种酶的活性都可采用外周血中红、白细胞或皮肤成纤维细胞测定。
诊断：
本病为少数可治性遗传代谢病之一，应力求早期诊断与治疗，以避免神经系统的不可逆损伤。由于患儿在早期不出现症状，因此，必须借助实验室检测。化验患儿血苯丙氨酸浓度增高，因为体内苯丙氨酸不能正常地转化成酪氨酸，尿中出现苯丙酮酸。
BH4缺乏症者单独用低苯丙氨酸饮食治疗可使血苯丙氨酸浓度下降，但神经系统的症状仍呈持续性进展。该病的发生率占PKU的10%左右，因此对所有高苯丙氨酸血症都应进行常规鉴别诊断。CT和MRI检查可见进行性脑萎缩。诊断主要依靠HPLC测定尿中新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)。如因6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)缺乏时所致的BH4缺乏症，尿中新蝶呤明显增加，N/B增高，B%<10%。如为二氢蝶呤还原酶(DHPR)缺乏时，N正常，B明显增加，N/B降低，B%可增高。三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH)缺乏者，尿中N和B均非常低，N/B正常。因特异性酶的测定较为复杂困难，可进一步作BH4负荷试验以助诊断。
在PKU的典型症状出现以后，诊断并不困难，但已为时过晚，因已失去预防脑损伤的时机。必须强调症状前诊断，即在宫内或新生儿早期确诊。我国有些城市正在开展对全部新生儿作PKU普遍筛查，以及时发现所有PKU婴儿。
苯丙酮尿症的预防
遗传病治疗困难，疗效不满意，预防显得更为重要，预防措施包括避免近亲结婚，推行遗传咨询，携带者基因检测及产前诊断和选择性人工流产等，防止患儿出生。
提倡母乳喂养，尽早发现苯丙酮尿症携带者和普及三氯化铁尿布，使已致病婴儿及早发现，及早治疗是预防智能低下的重要办法。
B. 种特定多环芳烃的高效液相色谱法测定
方法提要
利用正己烷-液-液萃取、固相萃取 C18柱-二氯甲烷提取水样中萘、苊等16 种特定多环芳烃，提取液经硅胶柱或凝胶渗透色谱净化、浓缩后，高效液相色谱-荧光-紫外检测器串联检测，外标法定量。
方法适用于地下水、地表水、饮用水及污水中的萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并 ［a］ 蒽、 、苯并 ［b］ 荧蒽、苯并 ［k］ 荧蒽、苯并 ［a］ 芘、茚并［1.2.3-Cd ］ 芘、二苯并 ［a.h ］ 蒽、苯并 ［g.h.i］ 苝等 16 种特定多环芳烃分析。
方法检出限与仪器灵敏度和样品基质有关，当取样量为 1.0L 洁净水时，本方法检出限为 0.50～10.00ng/L。
试样中共存色素、酯类化合物和其他性质相似污染物会干扰测定，需净化后测定。苯并 ［a］ 芘等多环芳烃见光易分解，制样和分析时应尽可能避光操作。
仪器与装置
高效液相色谱仪 荧光检测器和紫外检测器。
旋转蒸发仪。
氮吹仪。
振荡器。
硅胶层析净化柱 30cm × 1.0cm。净化前加入 6.0g 活化好的硅胶，干法装柱或将6.0g 硅胶放入 20mL 正己烷中湿法装柱，硅胶层上再加入 2.0g 无水硫酸钠。
分析柱 德国 Waters 公司 Waters PAHsC18 或美国 Supelco 公司 Supelcosil LC-PAH 液相色谱专用柱，规格 250mm × Φ4.6mm，粒径 5μm。
凝胶渗透色谱仪 (GPC) 美国 OI 公司。带 Phenomenex Envirosep ABC size 350 ×21.20mm 0micron 净化柱。
分液漏斗 1.0L，聚四氟乙烯活塞。
1L 棕色样品瓶。
试剂与材料
乙腈 HPLC 级。
二氯甲烷、正己烷 农残级。
无水硫酸钠、氯化钠 在 600℃高温炉中灼烧 4h，冷却后存放在干燥器中备用。
替代物标准 p-三联苯 称取固体苯并菲替代物标准，以甲醇溶液溶解、定容，并用甲醇逐级稀释为 10.0μg/mL 替代物储备液。将替代物标准添加到每个试样、标准和空白中，检验萃取、富集、净化和仪器分析过程中污染、损失、仪器分析误差以及样品基体的影响。
标准储备溶液 16 种 TCL PAHS Mix 标准溶液，萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并 ［a］ 蒽、 、苯并 ［b］ 荧蒽、苯并 ［k］ 荧蒽、苯并 ［a］ 芘、茚并［1.2.3-Cd］ 芘、二苯并 ［a.h ］ 蒽、苯并 ［g.h.i］ 苝等，浓度各 2000μg/mL。
硅胶 80～120 目，500℃高温炉中烘 5h，冷却后存放在干燥器中备用。使用前在一个浅盘中 130℃活化至少 8h，用金属铝箔轻轻覆盖，冷却后存放在干燥器中备用。
针头过滤器及注射器 针头过滤器型号孔径 0.45μm，直径 4mm，聚四氟乙烯滤膜。
分析步骤
1) 样品提取。
a.液-液萃取。将 1.0L 水样倒入预先加有 30g NaCl 的 1L 分液漏斗中，待 NaCl 溶解后加入 50mL 二氯甲烷、5μL 10.0μg/mL p-三联苯替代物标准溶液，并用 20mL 丙酮淋洗样品瓶，淋洗液转入分液漏斗，振荡 5min，静置 10～ 20min，二氯甲烷相转入 150mL平底烧瓶中。原样品再进行第二次萃取，萃取方法同第一次，二氯甲烷量减少为 30mL。合并二氯甲烷相，并加入 3g 无水硫酸钠，轻轻摇摇，观察有无结块现象，如有结块，补加无水硫酸钠至沙状，继续放置 20min，之后过滤于另一 150mL 平底烧瓶中。如果是洁净地下水样品则不需净化，滤液加入0.5mL 乙腈旋转蒸发浓缩至约3mL。转移至 KD 浓缩瓶中，氮气吹扫至 0.5mL，加入乙腈 0.5mL，氮气吹扫至 0.5mL，再加乙腈 0.50mL，氮气吹扫至 0.5mL，最后乙腈定容 1.0mL，0.45μm 滤膜过滤，HPLC 测定。如污染较重，则需净化。当采用硅胶柱净化时二氯甲烷滤液中加入 1mL 正己烷，旋转蒸发至 3mL，再加入 3mL 正己烷，继续旋转蒸发到约为 3mL，接方法 1 硅胶层析柱净化。当采用 GPC 净化时二氯甲烷滤液旋转蒸发至 5mL，再转移至 5mL 比色管定容至 3.00mL，接方法 2GPC 净化。样品净化一般污染样品净化选择硅胶层析柱净化方法，色素、脂类污染较重选择GPC 净化。
b.固相萃取。参见 82.16.1 分析步骤。其中淋洗液中加入乙腈后再旋转蒸发，最后定容溶剂也为乙腈。
2) 试样净化。
方法 1 硅胶层析柱净化。将 10mL 二氯甲烷-正己烷 (2 +3) 混合试剂和 20mL 正己烷通过硅胶层析净化柱 (规格 30cm ×1.0cm) ，待正己烷快要流完时，用 5mL 正己烷将待净化试液转移至柱上。在硫酸钠层快要露出空气之前，加 25mL 正己烷淋洗硅胶柱，弃去流出液。然后用25mL 二氯甲烷-正己烷 (2 +3) 淋洗硅胶柱，收集淋洗液在30mL KD浓缩瓶中，加 1mL 乙腈，氮气吹至 0.5mL，再加 2mL 乙腈，再次氮气吹到 0.5mL，最后乙腈定容至 1.0mL，0.45μm 滤膜过滤，HPLC 检测。
方法 2 GPC 净化。待净化试液定容至 3.0mL，取 2.5mL 上 GPC PhenomenexEnvirosep ABC size 350 × 21.20mm 净化柱。GPC 的流动相为二氯甲烷，定量环为 2mL，紫外检测器。清洗 15min 后上样，流速为 5mL/ min，柱温 24℃，收集所需馏分时间为 18～26min，排出废液时间为 5min。收集的馏分加入 1mL 乙腈，旋转蒸发至约为 5mL，氮气吹到 0.5mL，再加入 2mL 乙腈，氮气吹到 0.5mL，最后乙腈定容至 1.0mL，0.45μm 有机相滤膜过滤，HPLC 检测。
3) 校准曲线。配制 0.00ng / mL、5.00ng / mL、10.0ng / mL、20.0ng / mL、40.0ng / mL、80.0ng / mL 标准溶液系列，各标准点加入 10.0μg / mL1-氟萘、三联苯替代物各 10μL。通过浓度与对应峰面积建立标准曲线。
4) 高效液相色谱分析条件。A 泵 乙腈; B 泵 水; 柱温 30℃ ; 流速 1.5mL / min; 进样量 20μL; 梯度洗脱，洗脱程序见表82.33。紫外波长，280nm; 荧光检测器激发、发射波长见表82.34。
表82.33 梯度洗脱程序
表82.34 荧光检测器激发、发射波长
5) 色谱图(图82.10) 。
6) 定性及定量分析。
a.定性分析。采用与标准目标物保留时间相比较的方式对试样待测目标物进行定性分析。对有干扰存在或试样待测目标物含量达到方法检出限 5 倍以上的组分，需要进行气相色谱-质谱确证或其他方法确证。
b.定量分析。采用荧光和紫外串联检测的方式进行定量分析。以荧光检测定量为主，对有干扰存在的目标物应结合紫外检测情况综合确定定量的方式。定量方法为外标法。对自动积分的峰面积应逐一检查各峰基线，对不合理基线进行必要修正。
根据试样目标物测定浓度、萃取液定容体积和提取体积计算试样中目标化合物浓度。
岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术
图82.10 Waters PAH C18柱荧光检测多环芳烃液相色谱图
由5个浓度水平建立的校准曲线的线性相关系数必须满足R2≥0.995以上。
对含量接近检出限水平的试样，可以采用与其浓度相近的标准单点校准。对于含量超过校准曲线上限的试样应减小取样量，重新测定，使其峰面积保持在校准曲线的线性范围内。
7)方法性能指标。仪器的精密度、检出限及加标回收:以10ng/mL16种PAHS混合标准溶液平行测定10次，计算相对标准偏差RSD。以3倍于噪声的信号对应浓度作为仪器检出限。仪器的检出限、精密度见表82.35。
表82.35 仪器检出限、精密度
将质量为 20.00ng 的 16PAHs 种混合标准和 50ng 1-氟萘替代物标准加入到 1L 水样中，按试样分析步骤进行分析，基体加标回收率在 72.4%～121%，替代物 1-氟萘回收率为 65.7%～103%。
方法的线性范围: 在优化条件下获得了分析方法的线性范围及相关系数，见表82.35。荧光检测器的线性范围小于紫外检测器线性范围，特别是苯并 ［k］ 荧蒽由于响应非常灵敏，线性范围较窄，可以通过稀释或减小进样量使分析浓度保持在线性范围内。
质量控制
参照 82.14.1 质量控制部分。