浓缩集菌检测涂片方法

❶ 结核分枝杆菌的微生物学检查程序

（1）病料采集：取病畜禽的组织，肝，肺，脾等体液、分泌物及局部病灶的渗出液。

（2）镜检：对原始病料涂片进行革兰氏染色，镜检，应为革兰氏阴性。用印度墨汁等染料染色，可见清晰的荚膜。

（3）培养：同时接种鲜血琼脂和麦康凯琼脂培养基，37℃培养24h，观察细菌的生长情况，菌落特征、溶血性，并染色镜检。

（4）生化试验：多杀性巴氏杆菌在48h内可分解葡萄糖、果糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖，产酸不产气。

微生物学的主要任务：

1、在自然界物质循环中的作用。

2、空气和水净化、污水处理。

3、工农业生产：细菌、代谢产物、代谢活性。

4、对生命科学的贡献。

(1)浓缩集菌检测涂片方法扩展阅读：

微生物必须借助于显微镜才能看见的生物。在空气、陆地、河流和海洋里都有微生物分布，在人、畜和植物体内也有许多种微生物存在，有些是致病的，对人类有害，但是也有许多微生物对人类有益。

如制酒用的酒曲就是用某些微生物做的，整个发酵工业都离不开微生物。存在于土壤中的微生物叫作土壤微生物，它的种类也很多，大致可以分成细菌、真菌、放线菌等几大类，还有一些藻类、线虫等也可归入土壤微生物中。

❷ 结核病的实验室检查具体有什么呢

结核病的实验室检查有这些：

（1）结核菌细菌学检查痰涂片查抗酸杆菌是WHO推荐的肺 结核诊断方法，是全世界的结核病实验室都在使用的最基本的细菌学检 查方法。痰涂片检查不仅可以明确结核病传染源，而且十分经济，符合 我国国情。涂片的优点是简便、快速、价廉。涂片的缺点是阳性率低。 结核菌培养仍是目前诊断支气管结核病（MTB)的金标准，缺点是培养 时间长，特异性差。(2) 免疫学检测技术

① 皮肤变态反应：结核菌素或PPD实验，临床意义同前。

② 结核抗体测定：目前常用的检测方法主要有ELISA、免疫层析试 验、免疫印迹试验和蛋白芯片技术等检测血清抗体方法。

③ 结核抗原测定和循环免疫复合物（CIC)测定。

(3) 干扰素分析为体外测定结核菌抗原刺激诱发的T淋巴细胞分 泌y干扰素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物学方法检测核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR)可 检测样本中的结核杆菌核酸，并能鉴别耐药株。

(5) 血沉多增快，结合临床表现及X线检查可协助判断结核病的 活动性。

❸ 叙述结核杆菌的检验程序

结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。
结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。

一、结核杆菌检验程序
结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。

二、结核杆菌培养特性
1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。
2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。
3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。

三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。
【材料】
1. 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。
2. 抗酸染色液
3. 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。
【方法】
1. 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。
2. 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。
3. 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。
4. 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。
【结果】
1. 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。
2. 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。
3. 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。
4. 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。

四、荧光染色法
此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。

五、结核杆菌毒力试验——动物试验法

【材料】
1. 动物：体重200~250克豚鼠2只
2. 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。
2. 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下0.1ml
3. 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。
4. 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。
5. 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。

六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）
【材料】
结核病人24小时痰液，细口瓶，0.02%酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量0.5%NaOH摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。
2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。
3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。

(二)沉淀法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入0.02%酚红指示剂0.1毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。
2. 矫正PH为7.0，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。
3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。

附录：抗酸染液的配制
1. 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。
2. 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液0.1毫升即成。