检测蛋白分子量的方法

Ⅰ 如何准确测定样品中蛋白质的含量

5种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

二、双缩脲法（biuret法）

1、实验原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

2、试剂与器材

（1）试剂：a、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配制，酪蛋白用0.05n nach配制。

b、双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

（2）器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

1、实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

2、试剂与器材

（1）试剂

a、试剂甲： （a）10克碳酸钠，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 。溶解于500毫升蒸馏水中。 （b）0.5克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

b、试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，

开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准nach滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

c、标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、秒表

d、试管16支

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，

然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

1、试剂

（1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

（2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

（3）标准蛋白质溶液：同基本法。

2、操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

1、实验原理 双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

2、试剂与器材

（1）试剂：

a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

（2）器材：

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、试管16支

3、操作方法

（1）标准方法

a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

（2）微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

Ⅱ 测量蛋白质分子质量有哪些主要方法

1.根据化学组成测定最低分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算逗悉出蛋白质的最低分子量。2.
渗透压法当蛋白质浓度不大时，可用以下公式：
M=RT/lim(∏/C)
其中R是气体常数(0.082)，T是绝对温度，∏是好好渗透压（以大气压计），浓度单位是g/L。3.
沉降速度法:
M=RTs÷D(1－Vρ)
其中s是友指铅沉降系数，D是扩散系数，
ρ是溶剂的密度，
V是蛋白质的偏微分比容。4.
SDS-PAGE法:
lgM=K1－K2μR
其中K1和K2是与试验条件有关的常数。用已知分子量的标准蛋白作标准曲线，即可求出未知蛋白的分子量。

Ⅲ 未知蛋白质分子量范围,如何进行测定

方法1：SDS-PAGE电泳,通过加入的蛋白Marker各条带迁移率和未知蛋白的条带迁移率,再用软件可计算出来.
方法2：凝胶过滤层析：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一分钟成分的洗脱体积,并以洗脱体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量的标准曲线.测定未知物质的分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后,根据物质的洗脱体积,在标准曲线上查出它的的分子量.
另外还有离心沉降等等方法,反正有不少的方法

Ⅳ =测定蛋白质分子量的主要方法有哪些简述其原理（列举三种）

知道蛋白质分子量、氨基酸组成计算器
http://www.proteomics.com.cn/tools/mwcal/

一般的方法：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

[原理]

十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。

蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。

SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，每克蛋白质一般结合1.4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长椭园棒（短轴均为1.8nm，长轴则随蛋白质的分子量成正比变化），克服了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：

lgMr = K – bm

式中 Mr为分子量；K为常数；b为斜率；m为迁移率。

因此，用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr～迁移率的图中的位置，就能得知分子量。

用本法测得的分子量，除单链蛋白质外，均不是天然蛋白质的完整分子量，而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。本法对一些电荷异常，或构象异常，或带有大辅基的蛋白质不适用，如组蛋白F1和某些糖蛋白等。对一些结构蛋白如胶原蛋白等也不适用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照凝胶电泳系统中的缓冲液、pH值和凝胶孔径的差异可分为SDS-连续系统电泳和 SDS-不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可以分为SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直管型电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳两类。

本实验采用SDS-不连续垂直板型操作方法。通过实验使学生掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板式电泳的原理及技术，包括制胶、灌胶、加样、剥胶及固定染色等，学会用这些方法测定蛋白质分子量。

[方法与步骤]

一、加样液的制备

1、标准蛋白质加样液的制备 称取细胞色素，胰凝乳蛋白酶原，胃蛋白酶，卵白蛋白，牛血清白蛋白各0.5～1mg，置小离心管（Eppendorf管）中，加入样品溶解液1mL，充分溶解，如有不溶物应离心除去。沸水浴热处理3min，冷却备用。

2、待测蛋白质加样液的制备

根据待测蛋白质样品存在的状况而定。

（1）固体

待测蛋白样品，如为无盐的纯蛋白质固体制剂，加样液的制备方法同标准蛋白质加样液的制备；如为含盐的纯蛋白质固体制剂，应先加水充分溶解，对透析缓冲液透析12～16h，然后吸取0.5mL（蛋白浓度应为0.5～1mg/mL），置Eppendorf管中，并加入等体积浓样品溶解液，沸水浴热处理3min，冷却备用。

（2）液体

待测蛋白样品，如为无盐的纯蛋白质液体制剂，则加入等体积浓样品溶解液，然后热处理；如为含盐的液体制剂，则需先透析。

二、凝胶的制备

1、凝胶板的准备

（1）洗板

将洗洁精用温水稀释后，用它浸透海绵擦洗玻板，然后用自来水洗净，再用酒精将板擦干。

（2）安装制胶板

制胶前将玻板与塑料嵌条和凹型陶瓷板的边缘对齐，下沿用密封胶带封口，用塑料夹子或铁夹子将两端夹好，注意要确保密封，安放在固定架上。

2、分离胶和浓缩胶溶液的配制

组 分
分离胶/mL
浓缩胶/mL

凝胶贮备液
2.5
0.26

分离胶缓冲液（pH8.8）
1.9
—

浓缩胶缓冲液（pH6.8）
—
0.5

10%SDS
0.075
0.02

TEMED
0.026
0.02

双蒸水
3.05
1.22

10％过硫酸铵
0.013
0.02

总体积
7.6
2

注意：①最后加入10%过硫酸铵溶液，混合制成凝胶液，迅速灌制凝胶。

②丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用。因此必须小心操作，不得吸入和接触皮肤，聚合完全聚丙烯酰胺凝胶无毒。

3、制分离胶

将制胶板垂直放好，插上与相应厚度的样品梳，在梳子下缘线1cm处做标记，卸下样品梳。将配好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间，直至液面达到标记处。用滴管贴近胶液界面小心而又缓慢地覆盖厚度约0.5cm的正丁醇层，以防止溶液蒸发并保证胶面平整。

4、制浓缩胶

分离胶聚合后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗分离胶胶面两次，用滤纸吸去残液。用滴管将浓缩胶溶液加在分离胶面上，充满制胶板，插入样品梳。

（三）电泳

1、安装电泳槽

浓缩胶聚合后，除去梳子、密封胶带以及六个铁夹。将制胶扳、电泳糟内芯、另一对制胶板依次放入槽内。两制胶板的凹型陶瓷板均应与电泳槽内芯接触。然后插入楔型板以固定两套制胶板。如果每次电泳只用一块胶板，必须用提供的有机玻璃板代替另一套制胶板。

2、加样

在内外水槽加注缓冲液，使内外槽的水位均超过凹形板的缺口但低于塑料板的上沿。用微量加样器在梳井内加样。

3、电泳

盖好上盖，在80V～100V的电压下电泳约3h，至溴酚蓝指示的电泳前沿到达制胶板的下缘止，关掉电源。然后拔掉楔形板，取下制胶扳。

（四）染色、脱色

用刀片或薄板将白塑料板与陶瓷板轻轻撬开，用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。然后手戴橡胶手套将分离胶小心移入染色器皿中。在染色器皿中加入100mL考马氏亮蓝染液（含0.25%考马氏亮蓝R-250，30％乙醇，10％乙酸的水溶液），加盖，在摇床上染色2h。

将染液倒回贮存瓶（可反复使用）。在染色皿中加入100mL脱色液（10％乙酸，30％乙醇），振荡脱色至蛋白条带清晰。

[结果和计算]

1、凝胶脱尽底色后，色带清晰显出。按实样描下或摄下电泳图谱。

2、根据各蛋白迁移距离和染料迁移距离的比值，求出各蛋白的相对迁移率mr，然后作出lgMr～mr关系图，从图中找出未知蛋白mr对应的分子量。参考资料：http://jpkc.ecust.e.cn/17/experiment/exp/dy_2.htm

Ⅳ 最常用于测定蛋白质分子量的方法是

正确答案:A
解析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定蛋白质分子量
。

Ⅵ 如果测定某种蛋白质的分子量，采用何种层析法最好其原理是什么

需要测定蛋白质的分子量，可以直接用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳就可以了，层析法不能测定蛋白子的分子量，但是可以根据分子量的大小来分离开蛋白。

常用技术

1、沉淀，

2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

4、层析：利用蛋白质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。

(6)检测蛋白分子量的方法扩展阅读

产品特点

1、处理过程为单纯物理过程，无任何相变。设备操作温度低，避免了传统工艺的种种弊端;

2、系统采用先进的膜分离技术，工艺简单，运行稳定可靠，处理效率高;

3、可以对生产废水中的有用物质进行提纯回用，实现经济、环保双赢;

4、设备投资少，运行费用低。

Ⅶ 测定蛋白质分子量的常用方法

粘度法
凝胶过滤层析法
SDS-凝胶电泳
凝胶渗透（过滤）色谱法
渗透压法
质谱法包括电喷雾离子化质谱技术和基质辅助激光解吸电离质谱技术
光散射法（多角度激光散射）
沉降法（超速离心法）