检测蛋白纯度的方法

⑴ 蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的十种测定方法如下：

三、双缩脲法：

实验原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

四、BCA法：

实验原理：BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。

二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

五、Lowry法：

实验原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

六、考马斯亮蓝法：

实验原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

七、凯氏定氮法：

实验原理：凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。

但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。

八、Lowry法测定试剂盒：

Folin酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。定量范围为5～100μg/ml蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

九、BCA法测定试剂盒：

碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。

实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。

十、分光光度计法。

1、取八支（或者更多）干净的10ml离心管，标记上号。

2、取100ulBSA，加PBS2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml。

3、5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取10ml5×G250染色液，加入40ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

4、按下表加入试剂（以每孔5ml计，多余的用来清洗比色皿）。

⑵ 如何用HPLC进行蛋白质纯度检测及含量测定或测相对分子量

首先，蛋白质的测定一般用凝胶渗透色谱
分子量测定：用hplc测定几个分子量已知的蛋白质，绘制分子量与调整保留时间相对应的标准曲线，然后再在相同条件下测未知蛋白的保留时间，用标准曲线对照即可的未知蛋白的分子量；
含量测定：用蛋白质标样配制一系列不同浓度的蛋白质溶液，绘制蛋白质浓度与峰高/峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测位置样品的峰高/峰面积，即可得未知样品的浓度；
纯度测定：保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积/峰高除以所有峰峰面积/峰高的总和即可的目标蛋白的纯度。

⑶ 蛋白质纯度的测定方法有哪些

超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量.
含量测定方法很多：
凯氏定氮：灵敏度低,适用于0.1.0mg氮,误差为 ±2％,干扰少,费时8小时
双缩脲法（Biuret法）：灵敏度低1～20mg,中速20~30分钟
紫外吸收法：较为灵敏50～100mg,快速5～10分钟
Folin－酚试剂法（Lowry法）：灵敏度高 5mg,40～60分钟,操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)：灵敏度最高1～5mg,15分钟,常用
分子量测定：
SDS-PAGE：还原SDS测定结果比较接IC-MS,价格适中,常用
高效凝胶过滤色谱：标准蛋白质和待测蛋白质形状一致时,准确高,差别越大越不准确
电喷雾离子化质谱：最准确
等电点测定：在不同pH条件下测量蛋白质的电泳迁移率,然后用迁移率对pH作图,对应于迁移率为零的pH就是蛋白质的等电点.

⑷ 用什么进行蛋白质纯度的鉴定

SDS 聚丙乙烯酰胺凝胶电泳

考马斯亮兰法双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

⑸ 蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定分析方法有：马斯亮蓝法（Bradford）、Folin酚试剂法（Lowry）、BCA法等。
蛋白纯化是目前生物研究邻域中较为热门的一个大方向，其中蛋白含量测定是纯化过程中很重要的一项内容。
Folin酚试剂法（Lowry）是目前最灵敏的测定方法，但耗费时间长，操作需严格计时，颜色深浅随不同蛋白质而变化，因为其中的酒石酸钾-硫酸铜试剂配置保存困难，逐渐被考马斯亮蓝法取代。
考马斯亮蓝法（Bradford）是采用考马斯亮蓝G250染料与蛋白质结合，应用广泛，颜色稳定，专一性较差，干扰物质多。
BCA法主要基于双缩脲原理，用于快速检测，抗干扰能力强，但受金属螯合剂影响。
每种测定方法都不是完美无缺的，都有其优缺点，在选择时应考虑：试验所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定时所耗费的时间等因素。就具体情况选择最合适的试验方法。

⑹ 蛋白质纯度鉴定的方法有哪些

电泳,
蛋白质电泳 现在常用就是 SDS 聚丙乙烯酰胺凝胶电泳
特点
1）灵敏度高
2）测定快速、简便
3）干扰物质少
液相色谱
高效液相色谱是完全可以纯化蛋白质并且进行蛋白质纯度鉴定的
但建议还是使用蛋白质电泳 最主流 最有效的方法