㈠ 大肠杆菌的检测方法
多管发酵法。
多管发酵法是一种检测水体中大肠杆菌的传统方法，这种方法是在44.5℃的含有荧光底物的培养基上连续培养24h，而后能产生分解荧光底物——葡萄糖醛酸酶，从而释放出荧光产物，进而使培养基在紫外光照射下产生特征荧光。此方法可被用来对原样品中的菌落数作统计学估计。
在单料或双料乳糖胆盐发酵管内发酵，分离培养试验，利用伊红美蓝培养皿分离，接着是在乳糖发酵管中进行二次发酵，最后通过芽孢染色、革兰氏染色、显微枝兄枣镜观察等来完成。多管发酵法对试验条件要求不高，成本低，但是检测时间较长，容易受其他条件干扰，进而影响到测定结果的精确度。猛拆
(1)大肠杆菌定量检测方法实验扩展阅读：
注意事项：
1、检样时注意无菌操作。
2、稀释时采用的稀释液可以用磷酸盐缓冲液或生理盐水，接种时可采用九管法，设置三个梯度，分别为0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一个稀释度的试管应充分混匀。
3、每次实验需要有阴性对照。
4、使用小倒管培养基配制时，为排净气泡，灭菌时不要把尘唯试管的盖子盖的太紧，灭菌后注意观察一下倒管中的气体是否排完全、
5、高压灭菌后等高压灭菌锅的压力表达到0，取出培养基放到冰箱冷却，效果会比较好。
㈡ 食品中大肠杆菌的检测
用大肠杆菌显色培养基，检测原理：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;十二烷基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌;混合显色底物分别与大肠菌群和大肠杆菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上大肠菌群产生橙红色的菌落，大肠杆菌产生蓝绿色的菌落。
资料出自环凯官网。
㈢ 水中大肠杆菌的测定实验步骤
1、配制培养基：在培养皿中配制伊红美蓝固体培养基。一式三到五份。
2、水样稀释：均匀稀释。
3、接种并培养。
4、观察每个培养皿中的大肠杆菌的菌落（在伊红-美蓝培养基上，大肠杆菌菌落特征鲜明）数。取均值，即得实际值。这个菌落数就对应原水样中大肠杆菌的个数。
㈣ 检验食品中的大肠菌群需要注意的实验步骤有哪些
食品微生物学检验 大肠菌群计数：大肠菌群平板计数法（GB 4789.3-2010）
一 试剂和仪器
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB肉汤）
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
恒温培养箱
自动稀释仪
均质器
振荡器
二 样品处理
固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例，取密封状态良好的试样，备用待测。
三 检测过程
实验前准备
进入无菌操作室前应更换无菌实验服，戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后，首先用镊子夹取适量酒精棉全面擦拭双手，然后才能进行实验操作。
酒精易燃，因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离，防止出现危险，待手上的酒精挥发完全后，再进行实验操作。
样品的稀释
取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上，用酒精棉充分擦拭样品袋，将剪刀置于酒精灯外焰上充分灼烧，小心剪开样品袋。将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻，准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻，在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋，将均质袋放入拍击式均质器中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
注意：样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时可用1 mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。
均质完毕后，做好标记，将均质袋置于样品框中。
在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记，用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。同理，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不得触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
接种及培养
在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。
用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL，加入到培养皿中，备用。同理，加入1:100稀释液和空白液。注意，每个稀释度应接种2个无菌培养皿，空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。
加完样品梯度稀释液后，即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL～20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中，小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内，防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上，且倾倒过程应果断，防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜，不能过高或过低，温度过高不利于操作且对菌体有害，温度过低培养基迅速凝固，菌体不能在培养皿内均匀的分布，导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀，防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。
倒完培养基后，静置培养皿，等待培养基冷却凝固。
待培养基凝固后，再加3mL～4mL 结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是：使菌体均在培养基内部生长，以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后，翻转平板，置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h～24h。
平板菌落计数
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落，其中典型菌落的特征为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实实验
先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内，振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，于36℃±1℃条件下培养24h～48h。培养完毕后，观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者，即可报告为大肠菌群阳性。
㈤ 菌落总数大肠杆菌和致病菌的检测方法
大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1
设备和材料
1.1
温箱：36±1℃。
1.2
冰箱:0～4℃。
1.3
恒温水浴
:44.5±0.5℃。
1.4
天平。
1.5
显微镜。
1.6
均质器或乳钵。
1.7
平皿:直径为90mm。
1.8
试管。
1.9
吸管。
1.10
广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11
玻璃珠:直径约5mm。
1.12
载玻片。
1.13
酒精灯。
1.14
试管架。
2
培养基和试剂
2.1
乳糖胆盐发酵管:按GB
4789.28中4.9规定。
2.2
伊红美蓝琼脂平板:按GB
4789.28中4.25规定。
2.3
乳糖发酵管:按GB
4789.28中4.10规定。
2.4
EC
肉汤:按GB
4789.28中4.11规定。
2.5
磷酸盐缓冲稀释液:按GB
4789.28中3.22规定。
2.6
生理盐水。
2.7
革兰氏染色液:按GB
4789.28中2.2规定。
3
操作步骤
3.1
检样稀释
3.1.1
以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8
000-10
000
r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2
用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3
另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2
乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖
胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃
温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3
分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃
温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4
证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置
36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5
报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4
粪大肠菌群(faecal
coliform)
4.1
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置
培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2
结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
㈥ 乳品中大肠杆菌检测国标GB/T4789.38-2008的具体步骤及达标的标准
第一法大肠杆菌MPN 计数
操作步骤
6.1、 样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品：以无菌操作取259 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r / min ～1000r/ min 均质1 min～2 min ，制成l:10 样品匀液，或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1mol/L 盐酸（HCI）调节。
6.1.4、 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3 管月桂基磺酸盐胰蛋白陈（LST ）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）。36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h～48h 内产气的LST 肉汤管数。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环分别从所有培养48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中取培养物1 环，移种于已提前预温至45 ℃ 的EC 肉汤管中，放人带盖的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h ，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h ±2h 。记录在24h 和48h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。
6.4、 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃ 培养18h～24h 。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
6.5、 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃ ，培养18h～24h 。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
6.6 、生化试验
6.6.1、 靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36 ℃±1℃ 培养24h±2h 后，加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL～0.3 mL ，上层出现红色为靛基质阳性反应。
6.6.2 、MR -VP 试验：将培养物接种MR -VP 培养基，36 ℃ ±1 ℃ 培养48h±2h 。移取培养物1mL至13 mm×100mm 试管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h ，如出现伊红色，为VP 试验阳性。
将MR 一VP 培养液的剩余部分再培养48h 后滴加5 滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
6.6.3、 柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koser 氏柠檬酸盐肉汤，36℃±1 ℃ 培养96h±2h,记录有无细菌生长。
6.7、 大肠杆菌MPN 计数的报告
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋- -或-＋- -。只要有1 个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST 肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST 肉汤阳性管数查MPN 表，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌MPN 值。
第二法大肠杆菌VRB - - MUG 平板计数法
8、样品稀释
按6.1 进行。
9、 检验
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1 mL 注人两个无菌平皿。另取1 mL 稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。将45 ℃±0.5 ℃ 的VRB 琼脂10 mL～15 mL 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG 琼脂覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃ 培养18h～24h 。选择菌落数为10～ 100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG 阳性菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 ）和产气肠杆菌（如ATCC 13048 ）做阳性和阴性对照。
10、 大肠杆菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。
第三法大肠杆菌PetrifilmTM 测试片计数法
12、 样品稀释按6.1 进行。
13、 检验
13.1、 接种和培养
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，。揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml匀液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，将压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样品匀液均匀覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20 片，36℃±1 ℃ 培养。肉、家禽和水产品，培养时间为24h±2h；其他食品，培养时间为48h±2h 。
13.2、 判读
可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。 14 大肠杆菌测试片计数的报告
选择菌落数在15～150 之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。
如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1 乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150 ，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 ，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20 cm " ）。
这里可以下载此标准http://www.51zbz.com/biaozhun/134141.html