内毒素检测通常用的试验方法

A. 细菌内毒素中什么是定量法

目前,国内外广泛应用且检测技术比较成熟的细菌内毒素定量检查法主要有以下四种。
1. 1凝胶法是目前最常用的细菌内毒素检查法。即在10mm×75mm的小试管内,加入待检样品和鲎试剂各0. 1ml混合, 37℃、60 min保温反应后, 180°倒转,根据凝胶形成的情况(凝胶是否坚实)作为判定指标的一种半定量法。此法操作简单,经济而且不需要专用仪器。凝胶法既可限量检测内毒素,也可在0. 03 EU•ml-1以上进行半定量测定。
1. 2显色基质法(合成基质法、显色合成基质法, Chromoge-nic Technique)系根据细菌内毒素与LAL(或TAL)试剂中的C系反应所激活的凝固酶,使用人工合成的鲎三肽(即与PNA相连的显色基质如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作为显色基质,水解鲎三肽中的精氨酸肽链,通过测量反应液中释放出游离的对硝基苯胺(PNA)的吸光值而进行定量的一种检测方法。该法需要专用仪器。目前主要用于微量血浆、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的临床检验以及家禽、实验动物、人工脏器的安全性评估等方面。根据测定原理的不同分为终点显色法和动态显色法。
1.2.1终点显色法(EndopointColorimetric Assay)系根据在一定时间内游离出的PNA的量与细菌内毒素浓度成正比例关系进行测定的一种分析方法。PNA(黄色)的吸光度值可使用单波长405 nm或双波长(测定波长405 nm、参照波长492 nm)测量,或利用游离的PNA与红色偶氮试剂发生反应所形成的红色偶氮蓝复合物在545nm单波长或双波长(测定波长545 nm、参照波长630 nm)进行检测。一般可在0. 006~15 EU/ml范围内进行定量。
1.2.2动态显色法(Kinetic Colorimetric Assay)系根据游离的PNA的吸光度变化率(mAbs/min)与细菌内毒素浓度成正比例关系(比色反应速度法Pate Assay)或到达事先设定的反应吸光度变化值所需要的时间Ta的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系(比色反应时间法OD-Time As-say)进行测定的一种分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范围内进行定量。
1. 3酶联免疫测定法(ELISA法)基于抗原抗体的酶联免疫测定法,目前在国外应用十分普遍。主要由外加热原质刺激巨嗜细胞后产生的内热原物质(如TNF, TL-1等),而进行的定量测定方法。体外人全血热原检测方法是近年来国内外正在兴起的一种研究热原检测的新方法,具有检测范围广,灵敏度高,不同个体血液的结果差异小等优点[2, 3]。国内一些学者,已采用酶联免疫测定法对体外人全血热原检测方法的可行性进行研究和优化,取得了可喜的进展[4]。1. 4浊度法(Turbidim etrc Technique)系微量的内毒素与TAL(LAL)试剂中的C因子发生反应,由内毒素引发激活的凝固酶,切断凝固蛋白特定位置的精氨酸肽键,形成凝固蛋白从而产生凝胶过程中的浊度变化,采用适当的光学仪器测量的一种分析方法。此法操作比较简单、经济、灵敏度高,检测范围广。通常在0. 006~300 EU/ml的范围内进行定量,但需要专用仪器。根据测定原理的不同又可分为终点浊度法和动态浊度法。
1.4.1终点浊度法(EndopintTurbidimetric Technique)即根据到达规定点上反应液的最终浊度值(吸光度或透过光亮值)与细菌内毒素浓度成正比例或反比例的关系而进行测量的一种检测方法。由于未形成标准化,目前国内外都很少使用,也未见有专门仪器使用。
1.4.2动态浊度法(Kinetic Turbidimetric Technique)即根据测定到达事先设定反应液的浊度变化(吸光度变化)值所需要的时间(Ta比浊反应法)或浊度变化(透过光量比)值所需要的时间(Tg:比浊时间分析法)的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系或浊度的(吸光度值)每分钟变化(吸光度变化mAbs/min)与细菌内毒素浓度成正比例关系(比浊反应速度法)而进行测量的一种分析方法。通常,浊度法一般是指动态浊度法,而且在日、美、欧等国有专用仪器,并通过美国FDA认可,其中作为动态比浊仪一般要求为:恒温槽(37±1℃)、光源、检测器及内置数据分析等。其中检测波长从80~660 nm,主要根据仪器的不同而各异,检测时间为60~90 min之间。由于国内对细菌内毒素定量检查法的研究起步较晚,专门用于定量的高灵敏度TAL(最低检测限是0. 006EU/ml)还未研制开发出来,还受细菌内毒素检查用水(内毒素的含量小于0. 005 EU/ml)、内毒素标准品质量不高等因素的制约,对仪器定量法研究较多且检测技术较为成熟的就是动态浊度法。本法收载于2000年版《中国药典》二部附录中,在2005年版《中国药典》二部附录中,将浊度法和显色基质法修订为光度测定法,作为测定内毒素含量的方法。

B. 求助：注射用水的细菌内毒素检查方法

《中国药典》规定注射用水细菌内毒素限值为：0.25EU/ml
因注射用水无干扰成分存在，可以不用稀释直接检测，最简便的方法是采用灵敏度0.25EU/ml的鲎试剂（TAL））直接检查。
即 取8支灵敏度为0.25EU/ml的TAL，每支加0.1ml细菌内毒素检查用水（BET水）复溶，再分别制样品管2支（直接加入1ml注射用水）；阴性对照管2支；阳性对照管2支；PPC管2支，按药典规定操作。
加果采用 灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂 ，就要用BET水稀释一倍后再进行实验。

C. 细菌内毒素检测

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。所以热原有外生致热原和内生致热原之分。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。
一般来说内毒素是热原,但热原不全是内毒素。欧洲药典委员会副主席J.Van Noordwijk提出：“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。
热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查法，现已在《中国药典》2010年版二部、三部内广泛应用，但在《中国药典》2010年版一部内一个药品都未运用，这主要是由细菌内毒素检查法的持点所决定的：细菌内毒素检查法具有较家兔热原检查法灵敏、快速、简便易行、重现性好、结果准确等优点，目前细菌内毒素检查法已广泛应用于西药、生物制品。但同时也应该指出，细菌内毒素检查是一复杂的酶促反应过程，生产工艺的细微变化都可能引起其干扰的增加，然而根据中药制剂，成分复杂，影响因素多的特点，因此，中药注射剂一般还是采用传统的家兔热原检查法。但是对一些具有解毒降温作用的药物，因会干扰家兔的生理活性，引起体温下降，用家兔法检测不准，还是应考虑用细菌内毒素检查法。
由此可见，热原与细菌内毒素两者之间既有许多相同之处，但还是有区别的。同时，还要请各位同仁注意，不要将“热原”误写成“热源”。

D. 内毒素的检测

由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的，因此环境中大量存在内毒素。当内毒素通过机体消化道等方式时并无危害，少量通过注射等方式进入血液后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。内毒素大量进入、集聚于血液中，超过机体各自卫系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症。对于易于引入内毒素的药品医疗器械等必须通过内毒素检测。内毒素的检测常用家兔热原法和鲎试验法。中国药典收录的细菌内毒素检查法包括2种方法：凝胶法和光度法，使用鲎试剂来定性或定量检测内毒素。

E. 细菌内毒素的试验要求应该怎么做急急急提前感谢啦

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。我公司提供多种规格的灵敏度为0.03, 0.06, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 EU/ml的凝胶法鲎试剂。操作简便，经济，反应只需在37℃恒温水浴内进行。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程过程中浊度变化而定量测定内毒素含量的方法。目前，我公司有提供动态浊度法鲎试剂盒，配套微板鲎试仪ELU808使用，其检测范围宽，检测限可达到0.005EU/ml – 10 EU/ml，同时其样本检测量小，快速测定，多孔同时检测，可提高工作效率。
同时，有显色基质法鲎试剂盒定量测定内毒素含量，其检测时间短，抗干扰能力强，检测限为0.01EU/ml-1 EU/ml 。可配套使用微板鲎试仪ELU808 ， 通过96孔微板检测，最适宜的测定波长为405nm。也可使用分光光度计，通过试管检测，最适宜的测定波长为545nm。
凝胶法只能对样品中内毒素含量进行定性判断，也就是样品中的内毒素大于或小于某一个值，不能准确测定中样品的内毒素含量。而浊度法和显色基质法是定量测定内毒素含量的方法。

厦门市鲎试剂实验厂有限公司

F. 细菌内毒素检测鲎试剂实验方法有哪些

鲎试剂法就是细菌内毒素检测方法，它包括凝胶法和光度测定法。
凝胶法又分为限度实验和半定量实验。
光度测定法是定量实验，分为浊度法和显色法，其中浊度法又分为动态浊度法和终点浊度法，显色法又分为动态显色法和终点显色法还有重组鲎试剂法

G. 细菌内毒素国家药典是怎么检测的

10版国家药典
检测内毒素可以用凝胶法
凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

以上摘自2010版中国药典《细菌内毒素检查法》