A. 菌落总数大肠杆菌和致病菌的检测方法
菌落总数用平皿法,单位是个/ml(每毫升或毫克里面有多少的完整的菌落),方法是:在无菌操作的前提条件下,吸取1ml的原液加入到9cm的平皿里,在倒入3-5ml(37℃)的营养琼脂,在37℃的温箱里培养24小时,取出来计算它的菌落单位总数就行.
大肠杆菌用发酵法,单位是MPN/100ml(每100毫升或毫克的样品里面最大可能菌落形成单位)方法是15管法(适合食品)或9管法(适合非食品如游泳池水),用乳糖胆盐发酵管
致病菌用培养法,只要符合相应的化学，生物试验就可以判断为某致病均阳性
B. 菌落总数大肠杆菌和致病菌的检测方法
大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1
设备和材料
1.1
温箱：36±1℃。
1.2
冰箱:0～4℃。
1.3
恒温水浴
:44.5±0.5℃。
1.4
天平。
1.5
显微镜。
1.6
均质器或乳钵。
1.7
平皿:直径为90mm。
1.8
试管。
1.9
吸管。
1.10
广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11
玻璃珠:直径约5mm。
1.12
载玻片。
1.13
酒精灯。
1.14
试管架。
2
培养基和试剂
2.1
乳糖胆盐发酵管:按GB
4789.28中4.9规定。
2.2
伊红美蓝琼脂平板:按GB
4789.28中4.25规定。
2.3
乳糖发酵管:按GB
4789.28中4.10规定。
2.4
EC
肉汤:按GB
4789.28中4.11规定。
2.5
磷酸盐缓冲稀释液:按GB
4789.28中3.22规定。
2.6
生理盐水。
2.7
革兰氏染色液:按GB
4789.28中2.2规定。
3
操作步骤
3.1
检样稀释
3.1.1
以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8
000-10
000
r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2
用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3
另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2
乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖
胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃
温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3
分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃
温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4
证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置
36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5
报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4
粪大肠菌群(faecal
coliform)
4.1
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置
培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2
结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
C. 水中粪大肠菌群的测定
化妆品检测项目中粪大肠菌群的检测流程：
10g/mL样品+90mL灭菌生理盐水 →10mL+10mL双倍乳糖胆（含中和剂）培养基→粪大肠菌群 44.5℃，48h培养
注：在化妆品检测项目中，如果样品含有油脂性的成分，如精油，在样品前处理中需加入液体石蜡、吐温80、生理盐水进行均质，使样品能够均匀分散开来。
粪大肠菌群又是一个什么样的微生物呢？下面我们来详细介绍下：
大肠菌群：大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
定义（GB2010）：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
粪大肠菌群：大肠菌群的一种，又称耐热大肠菌群，培养温度：44.5±0.5℃，粪大肠菌群是化妆品检测项目中必检的微生物项目。
大肠埃希氏菌：（(Escherichia. coli )通常称为大肠杆菌。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：
致病性大肠杆菌(EPEC)、
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、
肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、
肠出血性大肠杆菌(EHEC)、
肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。
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水质微生物
一、水质微生物及指示菌
在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长，因此水体是仅次于土壤的第二种微生物天然培养基。水体中的微生物主要来源于土壤，以及人类的动物的排泄物及污染。水体中微生物的数量和种类受各种环境条件的制约。
一般认为，水中微生物以革兰氏阴性杆菌占有较大优势。与其他水体相比，河水及溪水中革兰氏阳性菌相对较多，这是因为陆地微生物冲洗污染的缘故。
水体中的致病性微生物一般并不是水中原有微生物，大部分是从外界环境污染而来，特别是人和其它温血动物的粪便污染。水中常见的致病性细菌主要包括：志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、小肠结炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌等。
在实际控制中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对各种可能存在的致病微生物一一进行检测，而一般利用对指示菌的检测和控制，来了解水体是否受到过人畜粪便的污染，是否有肠道病原微生物存在的可能，从而评价水的质量，以保证水质的卫生安全。
目前，世界各国一般认为大肠菌群是指示水质受粪便污染较好的指示菌。
我国水质控制也采用大肠菌群作为指示菌，GB5749-85《中华人民共和国国家标准 生活饮用水卫生标准》规定，生活饮用水中大肠菌群每升不得超过3个。
在某些情况下，水体中的细菌总数也可指示水体受粪便等污染物污染的情况。这里的细菌总数其实是指营养琼脂培养后形成的菌落总数。目前世界各国对于控制饮用水的卫生质量，除采用大肠菌群等指标外，一般还采用细菌总数这个指标。我国GB5749-85《中华人民共和国国家标准 生活饮用水卫生标准》中规定生活饮用水细菌总数每毫升不得超过100个。
二、水质微生物检验方法
GB5750-85《中华人民共和国国家标准 生活饮用水标准检验法》提供了水质中细菌总数和总大肠菌群的检测方法。
（一）细菌总数的检测：
国家标准中，细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
对生活饮用水，直接吸取1ml水样于平皿中，加入营养琼脂后混匀，37℃培养24h，进行计数。
对水源水，根据情况对样品进行10倍梯度稀释，选择适宜稀释液1ml，加注平皿，营养琼脂混匀，37℃培养24h，进行计数。
按照规定格式报告每毫升水中细菌总数。
（二）总大肠菌群的检测：
国家标准中，利用总大肠菌群作为粪便污染的指标。总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。
国家标准提供了多管发酵法及滤膜法检测总大肠菌群的方法。
多管发酵法检测总大肠菌群，分为三步：初发酵试验，平板分离，复发酵证实试验。初发酵试验，采用乳糖蛋白胨培养液37℃培养24h，观察产酸产气情况。对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，并根据标准所附检数表报告结果。
其中，对生活饮用水，初发酵试验接种水样总量300ml，即100ml接种2管，10ml接种10管，采用两个稀释度，12支发酵管。对水源水，初发酵试验接种水样总量55.5ml，即10ml接种5管，1ml接种5管，0.1ml接种10管，共采用三个稀释度，15支发酵管。两种接种方法，所用的检数表是不同的。
滤膜法检测总大肠菌群，就是利用微孔滤膜，过滤一定量水样，将水样中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜帖放在选择性培养基上（如品红亚硫酸钠培养基），经培养和证实试验后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，并计算出每升水样中含有的总大肠菌群数。
三、说明：
1．菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养。
2．培养时间。与食品中菌落计数不同，测定水中细菌总数，培养时间采用24h。
3．总大肠菌群的测定方法，由于饮用水和水源水可能的污染程度不同，因此采用不同的接种量，检数表也不相同。
4．当接种量超过1毫升时，一般采用多倍浓度培养液。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50mL，加入100mL水样后，总体积为150mL，培养液恢复到正常浓度。
5．滤膜法检测总大肠菌群，一般在检测较大量低浊度水样时采用，大量水样滤过滤膜后，水中所含有的所有细菌均截留在滤膜上。
E. 评价食品卫生质量的细菌污染指标及检测方法
食品中的细菌(包括非致病菌、 条件致病菌和致病菌)，有些是造成食品腐败变质的直接因素。因而常把污染食品的细菌总数、大肠菌群或大肠杆菌、肠球菌作为评价食品卫生质量的重要指标。
细菌总数，是指该食品上每个活菌细胞在培养基上生成肉眼可见的菌落。即菌落总数来表示。这种“细菌总数”实际上仅指活的杂菌，它可以作为食品污染的程度和新鲜度指标，是判断食品卫生质量的一项重要依据。
大肠菌群或大肠杆菌:大肠菌群以大肠杆菌为主，包括产气肠细菌和一些中间类型的细菌。大肠菌群来自人和温血动物的肠道，一般无病原性。据估计，成人每日从粪便中排出的大肠菌群细菌多达每克粪便中含有1千万≈1万万个。若水或食品中发现大肠菌群的细菌，则表示水或食品被人和温血动物粪便所污染，而有粪便的污染就可能有肠道病原菌(伤寒杆菌、痢疾杆菌等)。因此大肠菌群或大肠杆菌可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌。食品中大肠菌群的污染程度常用菌量表示。
肠球菌:肠球菌是链球菌属中一群革兰氏阳性球菌，呈长链状或短链状。与食品有关的链球菌，主要是粪链球菌和粪渣链球菌。肠球菌主要来源于粪便。过去和现在，大肠菌群或大肠杆菌长期以来作为粪便污染的指标细菌，广泛应用于一-般食品的常规细菌检验。但是这类细菌是嗜温菌，在低温、冰冻状态下容易死亡，这就降低了它应有的指标作用。将具有抵抗冰冻力的肠球菌作为指标细菌，用于冷冻食品的细菌检验，指标效果要优于大肠菌群，但检验方法要复杂得多食品卫生标准中，这三种不同的细菌指标，其卫生学意义不同，它们既有联系，又有区别，应根据实际情况加以应用，以对食品卫生质量作出正确的判断。
针对这一系列食品安全卫生标准检控，冠宇仪器微生物致病菌检测箱是我公司根据市场需求设计的一种专门针对微生物致病菌研制的检测箱，箱内配有齐全的采样工具、各类细菌类检测速测盒（菌落总数测试片、大肠杆菌大肠菌群测试片、食品大肠菌群测试片、餐饮具大肠菌群检测是纸片、霉菌、酵母菌测试片、沙门氏菌测试片、金黄色葡萄球菌测试片、大肠杆菌O157测试片、副溶血弧菌测试片、阪崎肠杆菌测试片、蜡样芽胞杆菌测试片、水中大肠菌群检测试剂盒等）、以及加厚铝合金外框，坚固耐用满足食品微生物采样检测需求。
F. 可以检测水质污染程度的微生物是什么
看你测什么咯，大肠杆菌的数量是一个很重要的水质标准。（溶解氧及大肠杆菌是两项可反映海水水质的重要参数。）
然后有人拿草履虫测铜离子浓度，（铜离子多了也是很有害的。）
要知道水质污染生物监测一般包括：生物群落法、细菌学检验法、水生生物毒性测定等等，所以很多生物都用于测定，而且像细菌检定是不看各个种类的细菌分别有多少的。
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水质污染生物监测
水环境中存在着大量的水生生物群落,各类水生生物之间及水生生物与其赖以生存的环境之间存在着互相依存又互相制约的密切关系.当水体受到污染而使水环境条件改变时,各种不同的水生生物由于对环境的要求和适应能力不同而产生不同的反应,因此可用水生生物来了解和判断水体污染的类型,程度.
用水生生物来监测研究水体污染状况的方法较多,如生物群落法,生产力测定法,残毒测定法,急性毒性试验,细菌学检验等.
2.6.1 生物群落法
(1)指示生物:生物群落中生活着各种水生生物,如浮游生物,着生生物,底栖动物,鱼类和细菌等.由于它们的群落结构,种类和数量的变化能反映水质状况,故称之为指示生物.
(2) 监测方法
1.污水生物系统法
该方法将受有机物污染的河流按其污染程度和自净过程划分为几个互相连续的污染带,每一带生存着各自独特的生物(指示生物),据此评价水质状况.
如根据河流的污染程度,通常将其分为四个污染带,即多污带,α-中污带β-中污带和寡污带.各污染带水体内存在着特有的生物种群.
2.生物指数法
是指运用数学公式反映生物种群或群落结构的变化,以评价环境质量的数值.
贝克生物指数(BI)= 2nA + nB BI=0时,属严重污染区域,BI=1-6时,为中等有机物污染区域,BI=10-40时,为清洁水区.
2.6.2细菌学检验法
水的细菌学检验,特别是肠道细菌的检验,在卫生学上具有重要意义.实际工作中,常以检验细菌总数,特别是检验作为粪便污染的指示细菌,来间接判断水的卫生学质量.
2.6.2.1 水样的采集
:严格按无菌操作要求进行,防止在运输过程中被污染,并应迅速进行检验.
2.6.2.2 细菌总数的测定
细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中,于37℃经24小时培养后,所生长的细菌菌落的总数.它是判断饮用水,水源水,地表水等污染程度的标志.
其操作过程如下:1)灭菌 ;2)制备营养琼脂培养基 ;3)培养(二份平行样,一份空白) ;4)菌落计数.
2.6.2.3 总大肠菌群的测定
总大肠菌群是指那些能在35℃,48小时之内使乳糖发酵产酸,产气,需氧及兼性厌氧的,革兰氏阴性的无芽孢杆菌,以每升水样中所含有的大肠菌群的数目来表示.
总大肠菌群的检验方法富有发酵法和滤膜法.发酵法可用于各种水样(包括底泥),但操作繁琐,费时间.滤膜法操作简便,快速,但不适用于浑浊水样.
2.6.2.4其他细菌的测定
2.7 底质监测
底质是沉积在水体底部的堆积物质的统称,是矿物,岩石,土壤的自然侵蚀产物,是生物活动及降解有机质等过程的产物.一般不包括工厂废水沉积物及废水处理厂污泥.底质是水体的主要组成部分.
G. 肠道致病菌的分类及常用检测方法
根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominantmicroflora)和次要菌群(sub—dominantmicroflora)。
①主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10～10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。
②次要菌群：数量在10～10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。
检测方法：
1、采样及稀释
（1）按无菌操作法将检样25g（或25mL）放于含有225mL无菌水的三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000～10000r/min的速度离心1min，做成1：10的稀释液。
（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1Ml，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀释液。
（3）根据食品的卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
2、乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管。
lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
3、分离培养
将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃温箱内培养18～24h，然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。
4、乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。
在上述选择性EMB培养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36±l℃温箱内培养24±2小时，观察产气情况。
凡乳搪发酵管产气，革兰染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。
(7)水质肠道致病菌检测方法扩展阅读：
有益菌菌群的生理功能：
如果肠内有益菌菌群占优，肠内黏膜呈现粉红色，表示肠内环境相当良好。
1、吸收水分，粪便较软，较易排泄
在胃部分解消化的食物，经由小肠吸收营养后，成为粘稠状物体送至大肠。然后再经过18小时将水分及矿物质吸收，就变成容易排泄的粪便。肠道内环境良好时，粪便的软硬适中，排便会较为顺利。
2、缓和的蠕动，能顺利将粪便排出
借由肠的蠕动，将粪便缓慢的推送至肛门。如果蠕动过快或太慢，都将影响粪便的构成，导致便秘或者腹泻。而如果肠内干净，则蠕动的速度就相当的有规律，粪便可顺利排出。
3、有助维他命的合成
比菲德氏菌等好菌能维护肌肤的健康，并具有合成有助热量产生的维他命B1、B2及B6等，以及与止血、骨骼形成有关的维他命K等之功用。健康的肠道，好菌会不断繁殖，维他命的合成也可顺利进行。
4、迅速排出有害物质
健康的肠道并非完全没有坏菌的存在，有害物质多少会产生。当然还包括，吃进体内的食品化学添加物或是无法成为营养成分的物质。只要肠内环境良好，这些物质在开始危害身体前就被排出体外。
5、避免病原菌的侵害
比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身体的免疫机能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特质，所以像是含有好菌的乳酸饮料或健康食品等，都可抑制病原菌在肠内繁殖。
肠道有益菌菌群除了以上功能之外，对人体还有营养作用，如糖尿病、高血压、高血脂等。B族维生素和非必需氨基酸对人类的毛发具有重要的作用，当缺少这些营养元素，会导致头发脱落或毛发发黄、发叉，容易折断等现象。