‘壹’ 基因表达量的研究方法
差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。简单介绍如下：
DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：
①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；
②在逆转录酶作用下，以Oligo dT12MN为锚定引物将mRNA反转录成cDNA；
③ 以cDNA为模板利用10一mer随机引物和锚定引物进行PCR扩增；
④ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，结合银染等显色方法获得平行材料间的差异cDNA片段，回收并再扩增差异片段；
⑤Northern blotting检测差异cDNA片段是否为阳性片段；
⑥克隆cDNA片段并测序；
⑦ 根据测序结果筛选cDNA文库或使用RACE技术获得cDNA片段侧翼序列，进而获得其全长cDNA基因。
GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决目前用来检测基因表达差异的方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤，反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时，通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列，而其5′端包含了随机ACP的通用序列。第三步: 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR，这时使dT-ACP2和随机ACP能各自退火结合到第二步得到双链cDNA的3′ 端和5′端。既然第二链cDNA的3′端序列与随机ACP引物的通用序列互补，而其5′端与dT-ACP2的通用序列互补，这样保证了只扩增目标产物。该技术特点如下
(1) 无假阳性。GeneFishing技术鉴别的差异表达基因均可通过Northern Blot分析或RT-PCR证实！现有的DEG检测方法，例如生物芯片和差异显示技术的主要瓶颈就是假阳性的存在。无假阳性可以使研究者能快速辨别可信的差异表达基因。
(2) 无需PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），琼脂凝胶法即足够。退火控制引物(ACP)极大地提高了PCR扩增的特异度和灵敏度，从而产生特异PCR产物。而且，GeneFishing 技术只需要少量的起始物质。PCR产物可以在标准的溴化乙啶染色的琼脂凝胶中被检测，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）的繁琐处理步骤。使用GeneFishing 技术在琼脂凝胶中产生的条带具有足够浓度，可以被Northern Blot方法检测。
(3) 无需昂贵的检测方法。放射性/荧光检测方法由于其成本和危险性而不能广泛应用。昂贵的检测方法是现今差别表达基因检测的另一缺点。因此，可以使用标准溴化乙啶染色的琼脂凝胶来进行检测是GeneFishing 技术的一个主要优势。
(4) 重复性保证。GeneFishing技术的所需反应试剂均由试剂盒提供。这样防止了由于使用旧的，不匹配的试剂而带来的变化，确保了可靠的重复性。
(5) 无需特殊技术。GeneFishing 技术是一种以PCR技术为基础的创新方法，简单易用。
(6) 快速经济。GeneFishing技术使得研究者可以在5小时内确认有效的差异表达基因，不必因为假阳性而浪费时间。相比之下，所有其他DEG筛选方法都需要大量的后续工作和时间来鉴别有效的差异表达基因。
(7) 大范围的PCR产物。每一个GeneFishing PCR反应产生从150bp至2kb长度范围的PCR产物，这不仅提高了鉴别差异表达基因的机会，还为预测基因功能提供了更多的有效序列信息。
基因芯片技术的原理类似我们日常所说的计算机芯片，只是在固体基质上的不是集成着各种半导体管，而是成千上万的基因探针，待分析的样品通过和芯片中已知序列的DNA片段碱基互补杂交，经过计算机的分析，从而确定待测核酸序列和性质，表现出基因表达量和一些序列本身的特性。该技术主要包括四个环节：芯片微列阵制备，样品制备，生物分子反应和信号的检测分析。目前的制备方法主要是采用表面化学的方法或是组合化学的方法来处理固相基质，如玻璃片或硅片。在固体材料中刻出微滤栅、微通道，并加上微泵、微阀来控制流体。然后将探针以预先设计的顺序固定在固体基质上。微列阵制备技术主要有两种基本方法：原位合成法和点样法。
以上三项技术比较如下：
发现新基因
假阳性
PCR产物长度
检测方法
重复性
GeneFishing
能
没有
达到2kb
琼脂糖凝胶
高
Gene Chip
否
高
N/A
荧光
低
DD-PCR
否
高
100-500bp
荧光或放射
低
参考资料：试验方案
‘贰’ 检测dna上的目的基因是否表达常用的检测方法是
A 对目的基因的检测和表达检测的方法混淆，不能准确应用。目的基因的检测常采用DNA分子杂交技术，即将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若出现杂交带，则表明目的基因已插入到染色体中。DNA—RNA分子杂交与抗原——抗体杂交法是目的基因的表达检测。目的基因是否转录出了相应的信使RNA分子，用DNA—RNA分子杂交法检测。细胞内是否合成了由目的基因控制的蛋白质，使用抗原——抗体杂交法检测。要准确区分目的基因的检测和表达检测使用的方法。显微注射技术是目的基因导入受体细胞的方法。
‘叁’ 外源基因表达的检测是什么
检测外源基因是否转化成功，首先对报告基因进行检测，然后再进行目的外源基因的检测。目的外源基因的表达可分转录和翻译两个水平，转录是以DNA为模板合成mRNA的过程，翻译则是指以mRNA为模板翻译成蛋白质。目的基因表达检测亦可在两个水平上进行，在转录水平上对mRNA进行检测，在翻译水平上对蛋白质进行检测。
1.报告基因的酶法检测
主要的报告基因，例如Gus基因、Cat基因、冠瘿碱合成酶基因、NptⅡ搭庆汪基因和荧光素酶基因皆可根据各自的功能，采用酶法检测。
2.外源基因转录水平上的检测。
Northern杂交（Northernblotting）以RNA为探针，检测外源基因转录产物特异mRNA。Northern杂交也有斑点杂交和印迹杂交。斑点杂交只需将RNA样品点样在固相膜上直接与探针杂交，但只能鉴定外源基因是否转录；而Northern印迹杂交则需将RNA样品进行电泳分离，然后转移到固相膜上，再与探针杂交，可对外源基因的转录状况进行较详细的分析。Dot-Northern杂交是将总RNA提取物经多孔过滤进样器直接转移到杂交膜上，其余步骤与Northern杂交相同。Northern杂交对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。
3.外源基因翻译水平上的检测
外源基因翻译水平上的检测通常用Western杂交（Westernblotting）。Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的知仔特异蛋白质检测方法。转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解在含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离开来，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性座位。然后差岩加入特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白与一抗结合后，再加入能与一抗特异性结合的二抗，二抗事先已经标记，根据二抗上标记化合物的性质检出。由检测结果，可知目的蛋白是否已在被检植物细胞中表达、其浓度以及大致的分子量。
‘肆’ 检测基因表达水平差异的方法有哪些
基因的表达是dna-rna-蛋白,期间有转录水平调控、转录后调控、翻译后调控等多种调控机制影响该基因的表达.
所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表达多,可能是mrna多,也可能mrna变化不大,而是翻译多了；蛋白表达少,原因亦然.
从2个水平检测一个基因的表达,可以更全面地了解该基因在该组织某个时期或某种条件下的变化受到什么水平的调控.
所谓基因表达,就是从dna到mrna再到蛋白的一个过程,基因表达水平一般是通过该基因转录的mrna的多少来衡量的.
每个基因转录产生的mrna的量,是受到时空等多种因素调控的,个体在不同的生长发育阶段,或者不同的组织水平,基因转录出mrna的量都是不一样的.
例如,当某种植物长期生长在高盐的环境里,该植物体内与抗盐相关的基因的表达量就会增加,以适应这种高盐环境,是植物能够生存下来,这时植物抗盐相关的基因表达水平就相对高
检测基因表达的方法：
转录水平检测：rt-pcr，real-time pcr，northern blot
翻译水平检测：western blot
还有直接检测，如报告基因、融合荧光蛋白等。
rt-pcr是反转录pcr，是半定量方式。real-time pcr可以精确定量。 二者不同。后者为了区别于rt-pcr，一般不缩写。
各位观众老爷们大家好!我是吆五，打算从今以后不定期分享一些生物类的专业知识。
一方面供自己学习积累，另一方面也希望对大家有所帮助。
生物是很枯燥的呢
‘伍’ 如何检测基因表达水平
1 western bloting
a.将编码目标蛋白基因通过载体进行体外重组，然后导入宿主细胞表达
b.将目标蛋白注入兔子或其他动物体内获得一抗
c.将样品蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移、吸附固定
d.用一抗与之杂交再用二抗检测其是否表达
2 fluorescent real-time PCR
a.提取样品总RNA，再通过超速离心获得mRNA
b.用逆转录酶获得cDNA
c.加入特异性探针
d.利用专门的仪器检测荧光强度即可
3半定量 PCR
a.提取样品总RNA，再通过超速离心获得mRNA
b.用逆转录酶获得cDNA
c.做半定量PCR
4cDNA microarray
5蛋白质 芯片
实质就是高通量的分子杂交，免疫酶连反应再运用计算机处理
‘陆’ 想测试一个基因的MRNA表达量，用什么方法最好如果是原位杂交和免疫组化是不是定量不准那RT-PCR呢
对于基因蛋白表达的定量一般不会用到原位杂交和免疫组化，这两个方法的优点是更加直观，但定量困难，适合用作定性实验。个人认为定量实验检测最好用RT-PCR进行核酸层面的检测，或者用免疫学方法直接检测蛋白量，比如ELISA等；蛋白电泳（包括2D）可以进行半定量的实验。另外定量实验要注意的是选择合适的内参，电泳要注意平衡好上样量。
‘柒’ 检测目的基因是否表达的方法是
基因工程第四步中包括导入检测，转录检测和翻译检测，方法分别是DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术。有的还可在个体水平是进行检测，如抗性检测等
‘捌’ 列举3种研究基因在体内表达方式的试验方法
目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb/c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶(luc+)蛋白的重组质粒(pGL-3-CMV)或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部(2μg质粒DNA/4.5Mpa/枪)。于质粒注入后24~144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法