大肠菌的三种检测方法

A. 怎么检验饮料中的大肠杆菌

大肠杆菌检验（包括(一)检验方法；(二)培养基 ）

(一)检验方法
1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃ 温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革
兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
4．报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l 00ml(g)大肠菌群的最可能数。
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(二)培养基

①乳糖胆盐发酵培基

成分：蛋白胨：20g
猪胆盐(或牛，羊胆盐)：5g
乳糖:10g
0．04％溴甲酚紫水溶液: 25m1
蒸馏水: 1 000m1
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管l 0ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。
用途：乳糖发酵试验用。
原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。
乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。
糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。
大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。
注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)

②伊红美蓝琼脂培基
成分：蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 17g
2％伊红Y溶液 20ml
0．65％美蓝溶液 10ml
蒸馏水 1000ml
pH7.1
制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121℃15分钟备用。临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。

③乳糖发酵培基
成分：蛋白胨 20g
乳糖 10g
O．04％溴甲酚紫水溶液 25ml
蒸馏水 1000ml
pH7．4
制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注： ’
(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群
证实试验用。
4．蛋白胨水
成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1 000ml pH7．4

B. 纯净水的大肠菌群的检测方法

2.7细菌总数：（详见卫标） 2.7.1方法：以无菌操作方法用已灭菌过1 ml吸管,吸取已摇匀的水样1 ml注入已经过121℃20分钟灭菌的90ml生理盐水的三角烧瓶中,摇匀,称1：10的供试液.另取灭菌吸管1支,从三角烧瓶分别吸取为1：10的供试液1 ml注入经160℃2小时灭菌平皿中（共注三个平皿）.然后各平皿倒入已灭菌熔化的肉汤琼脂培养基约15ml,摇匀.另再倒空白平皿,作对照.待冷却凝固后,翻转平皿（底朝上）置36.5℃恒温培养箱内培养48小时后进行细菌计数.2.7.2细菌计数：将三个平皿中的平均菌落数,以稀释度的选择乘以其稀释倍数,即为水样的细菌总数.一般都是检测细菌总数的!

C. 食品中大肠杆菌的检测

用大肠杆菌显色培养基，检测原理：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;十二烷基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌;混合显色底物分别与大肠菌群和大肠杆菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上大肠菌群产生橙红色的菌落，大肠杆菌产生蓝绿色的菌落。
资料出自环凯官网。

D. 大肠杆菌怎么鉴定

大肠杆菌测定
伊红美蓝平板上典型大肠杆菌菌落接种到营养琼脂平板，在(36土1)℃培养18h -24 h 。每个平板至少挑选2个菌落。挑取上述菌落纯培养物接种3.6.3生化培养基和乳糖发酵管，(36士1)0C培养24h 后观察结果。

大肠杆菌与非大肠杆苗鉴别试验方法

靛基质试验:
滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 m L于靛基质试验培养基中混合，静置，观察结果。
出现红色环的为反应阳性;出现黄色环的为反应阴性。

甲基 红(MR)试验:
滴加甲基红指示剂0.2 m 1于MR-VP培养基中混合，观察结果。
出现红色为阳性反应;出现黄色为阴性反应。

维 培(VP)试验:
滴加VP试剂甲液0. 2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1mL混匀，静置，观察结果。在15min内出现红色的为阳性反应;无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1h后再观察一次出现红 色也为阳性反应。

西蒙氏柠檬酸盐试验:观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应;不变色为阴性反应。

大肠杆菌鉴定结果
靛基质 MR VP 西蒙氏柠檬酸盐 鉴定
＋
－ ＋
＋ －
－ —
－ 典型大肠艾希氏杆菌
非典型大肠艾希氏杆菌
＋
－ ＋
＋ －
－ ＋
＋ 典型柠檬酸盐杆菌
非典型柠檬酸盐杆菌
－
＋ －
－ －
－ ＋
＋ 典型产气肠杆菌
非典型产气肠杆菌

如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。

结果报告
1M Vic 试 验结果为++一一、一+一一和乳糖发酵管产气者，查其EC肉汤产气管数及其稀释倍
数，对照附录B(资料性附录)中MPN检索表报告样品中大肠埃希氏杆菌MPN /a (mL)值

E. 如何鉴定大肠杆菌

1、发酵法

这种方法主要是在44.5℃下的培养基上进行大肠杆菌的培养，该培养基含有荧光底物，需要培养 24 h。然后对荧光底物进行释放，需要采用葡萄糖醛酸进行，让培养基能够在紫外光的照射下发出荧光。

采用这样的方式方法，还可以进行统计学估计原来样品中的菌落。主要步骤包括发酵、分离培养、二次发酵、显微镜观察等 。

2、滤膜法

该方法主要过程：加入 10 mL 左右的无菌水于滤器中，然后掺入一些无菌水进行清洁滤器的内壁，再进行过滤，将滤膜放在 M-FC 培养基中，两者之间不能够有气泡，然后进行密封，存放温度为 44.5℃，存放时间约 24 h，直到大肠杆菌的菌群变成蓝色或蓝绿色。

然后记录数据，估算每一单位的水溶液菌群数量，然后进行大肠杆菌量值的换算 。

(5)大肠菌的三种检测方法扩展阅读：

大肠杆菌是短杆菌，两端呈钝圆形，革兰阴性。有时因环境不同，个别菌体出现近似球杆状或长丝状 ；大肠杆菌多是单一或两个存在，但不会排列呈长链形状。

大多数的大肠杆菌菌株具有荚膜或微荚膜结构，但是不能形成芽孢；多数大肠杆菌菌株生长有菌毛，其中一些菌毛是针对宿主及其他的一些组织或细胞具有黏附作用的宿主特异性菌毛 。

生化特性

大肠杆菌在常用的生化特性检测项目中，甲基红试验呈阳性，吲哚产生和乳糖发酵是阳性（个别菌株表现阴性），维-培试验是阴性，尿素酶和柠檬酸盐利用呈阴性（极个别菌株表现阳性），硝酸盐还原试验表现阳性，氧化酶表现阴性，氧化-发酵试验表现为F型