㈠ 谁知道测DNA甲基化的方法
http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多图片粘贴不过来，还不如你自己看。
一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在肿瘤发生时，肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% , 同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的广泛研究。
近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
从原理上来看，Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测，以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据，通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本，并用混合的PCR产物
作为校正。其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变。因而，用它处理样本后，再进行PCR扩增，甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理，它的基因频率为0－100％。在此，我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点。这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和精确性。实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的，而在肿瘤样本中高甲基化。通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段，并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）。使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物，其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替，以减少计算的数量。再通过人工检测测序引物可能存在的错配。此外，同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照，扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景。
PCR引物设计完全与模板相匹配，不覆盖任何甲基化多态性区域。使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物，10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段，扩增片段长度为144bp。反应体系为60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，终体积为50μL。PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟，然后在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环，最后一步延伸步骤在72℃下4分钟，中止反应。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳动物基因组中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一种基因外修饰，不改变DNA的一级结构; 他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用. 全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象. DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
㈡ 易基因 | ACE-Seq：羟甲基化检测简介
DNA序列中胞嘧啶（C）5’ 碳位结合一个甲基基团而转变成5mC的现象称为DNA基甲基化。在5mC去甲基化的过程中，其会被氧化成5hmC，这种新的修饰称为DNA羟甲基化。
因为5hmC是5mC去甲基化的中间产物，所以对于多细胞来说，同一个C位点上不同细胞往往会存在5mC或5hmC不同修饰，而5mC与5hmC对基因表达的调控作用又完全不同：启动子区的DNA甲基化对基因表达的有抑制作用，DNA羟甲基化则会促进基因的表达。因此，对5mC及5hmC的水平进行精确地定量并分别研究十分有必要。
ACE-seq是一种全新的检测DNA羟甲基化的技术，由美国宾夕法尼亚大学Emily K Schutsky等在2018年发表在Nature Biotechnology杂志上。不同于传统的BS-Seq，该技术使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)代替化学脱氨，保证了DNA的完整性。A3A能够特异地脱去C及5mC的氨基使其变为U，而5hmC则因为不被该酶识别，测序时仍被检测为C。这样，便将5hmC与C及5mC区分开来。该技术原理示意图如下：
首先，利用T4 β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC转化成5ghmC，5ghmC不会被A3A酶脱氨基；然后，利用A3A酶特异去除C和5mC的氨基，使其转变成U，而5hmC保持为C，从而将5hmC和C/5mC区分开来。
ACE-Seq具有以下优势：
（1）检测范围为全基因组，可以得到基因组上大部分C位点的羟甲基化水平。
（2）单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的羟甲基化水平，精确度高。
（3）低起始量。ACE-Seq利用脱氨酶实现5hmC与C及5mC的区分，反应条件温和，不破坏基因组，大大减少基因组DNA的损失，因此起始DNA量比常规的oxBS技术降低100倍。
（4）高准确性。绝大部分甲基化修饰的C都被转化成U，而绝大部分经过糖基化修饰的5hmC（5ghmC）则保持为C，表明该技术具有充分的可靠性。如下图：
（5）经济性。仅需一个文库解决问题，羟甲基化研究成本大大降低。 ACE-Seq独有的优势使其在羟甲基化检测领域拥有巨大的潜力。
为了让大家全面理解掌握自己究竟该选择哪种羟甲基化研究技术，我们再来温习一下oxWGBS-Seq。该技术将传统的BS-Seq技术与化学氧化相结合，先利用高钌酸钾将DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亚硫酸盐处理，5fC和没有任何修饰的C就被转化成U，而5mC则不会被转化，仍然保持为C。原理示意图如下：
该技术需要构建两个文库，图中蓝色虚线标出的为BS文库，紫色虚线标出的为OXBS文库。利用BS文库可以得到5mC和5hmC总的水平，利用OXBS文库可以得到精确的5mC的水平，两个文库相减，即可得到精确的5hmC的水平。根据该技术的原理可知，该技术可以同时得到精确的甲基化水平和羟甲基化水平。
oxWGBS具有以下优势：
（1）可以同时检测甲基化和羟甲基化的水平。
（2）检测范围为全基因组，可以得到基因组上大部分C位点的甲基化和羟甲基化水平。
（3）单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的甲基化和羟甲基化水平，精确度高。
由于以上优点，oxWGBS被称为精准甲基化和羟甲基化检测的“金标准”。
根据oxWGBS还可以衍生出oxRRBS技术。oxRRBS是简化代表性重亚硫酸盐测序（RRBS-Seq）技术与化学氧化技术的结合，可以针对基因组上CpG含量高的区域（如CGI，启动子等重要的调控区域）进行甲基化及羟甲基化水平检测。由于oxRRBS只针对CpG含量高的区域进行检测，而这些区域往往是重要的调控区域，使得oxRRBS技术能够以较低的成本检测关键基因组区域的甲基化及羟甲基化水平。
然而以上两种技术有两个共同的缺点。首先，由于重亚硫酸盐处理对DNA有强烈的破坏作用，导致建库过程中会损失大量DNA，因此该技术需要的DNA起始量较高；另外，由于该技术需要构建两个文库，会导致成本的上升。
此外，还可以利用hMeDIP-Seq技术来检测DNA羟甲基化。hMeDIP利用5hmC特异性抗体富集基因组上发生羟甲基化的DNA片段，结合高通量测序，检测基因组上羟甲基化的区域。原理示意图如下：
该技术针对羟甲基化的片段进行测序和定量，成本大大降低。但该技术无法达到单碱基分辨率，也无法得到精确的羟甲基化率，只能得到羟甲基化修饰的信号强度。
㈢ 简化甲基化测序和甲基化测序的区别
普通的测序不能找到甲基化位点。
这里有几种常用的找甲基化位点的测序方法：
第一种是重亚硫酸盐测序。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。
第二种甲基化DNA免疫共沉淀MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）测序，是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）测序是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。
第三种是三代测序技术，采用pacbio测序仪的SMRT技术，采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
㈣ 易基因｜一文读懂：十大DNA甲基化研究核心问题
DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一，近年来关于DNA甲基化的研究成果屡屡见刊。我翻阅各类文献，为大家总结了十大DNA甲基化研究核心问题，包括什么是DNA甲基化，DNA甲基化的主要形式、DNA甲基化与去甲基化、植物中的DNA甲基化、DNA甲基化的主要功能、DNA甲基化作为生物标志物的潜力、DNA甲基化的主要研究方向、DNA甲基化检测方法、样本不同如何选择DNA甲基化检测技术、DNA甲基化数据挖掘等，让您一文读懂DNA甲基化。
1、什么是DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，是指DNA分子在DNA甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到特定碱基上的过程。DNA甲基化能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是最重要的表观遗传调控方式之一。
2、DNA甲基化的主要形式
5-甲基胞嘧啶（5-mC）：最重要的一种DNA甲基化修饰，广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中, 称誉为“第五碱基”。
5-羟甲基胞嘧啶世衫腊（5-hmC）：哺乳动物的“第六碱基”。
N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）：在细菌、藻类及动植物基因组中存在。
7-甲基鸟嘌呤（7-mG）
3、DNA甲基化与去甲基化（5mC）：
DNA甲基化反应分为2种类型：一种是2条链均未甲基化的DNA被甲基化，称为从头甲基化（denovo methylation）；另一种是双链DNA的其中一条链已存在甲基化，另一条未甲基化的链被甲基化，这种类型称为保留甲基化（maintenance methylation）。
甲基化的DNA可以发生去甲基化。DNA的去甲基化由基因内部的片段及与其结合的因子所调控，包括：
主动去甲基化(Active demethyaltion)：哺乳动物TET酶主动去甲基化，5mC经过TET作用转化成5hmC。
被动物甲基化(Passive demethylation)：DNA通过不断复制丢失/稀释甲基化。
4、植物中的DNA甲基化
对于植物而言，面对生长环境塌颂的改变，表观遗传的变异会改变植物DNA的构象，从而改变染色质和蛋白质的结构，达到调节基因组的作用。研究发现，当植物面临生物胁迫和非生物胁迫时，植物基因组中DNA甲基化会发生改变，并且这些改变会遗传给后代。所以DNA甲基化的改变能够丰富植物物种的多样性，加强植物的环境适应性。
不同于哺乳动物基因组只有CG甲基化，植物基因组甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的碱基）甲基化。而维持这三种不同的DNA甲基化的分子机制非常复杂。
5、DNA甲基化的主要功能
DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式改变，从而控制基因的表达。
保持基因组遗传物质的稳定性（TE的高甲基化）
调控基因的表达（顺式作用元件的动态甲基化，如Promoter/Enhancer等）
DNA甲基化参与基因转录调控、细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、基因印记和肿瘤的发生等过程。
6、DNA甲基化作为生物标志物的潜力
相比基因组，DNA甲基化能够反应环境的影响
DNA甲基化不像基因组那么一成不变，也不像转录组和蛋白组那么搜滑不稳定。
DNA甲基化处于动态变化中，能够像年轮一样记录环境因素的影响。
DNA甲基化标志物是最有应用前景的表观遗传标志物 。
7、DNA甲基化的主要研究方向
8、DNA甲基化检测方法
目前研究中常用的DNA甲基化测序方法包括全基因组（WGBS、oxWGBS等）、简化基因组（dRRBS、RRBS、XRBS等）、靶向基因组（液相捕获）、靶向基因（TBS）和850K芯片等，适用于多种不同应用场景。
WGBS和RRBS用于基因组范围内研究探索，并筛选目标基因（候选DNA甲基化标记物）
TBS用于后续目标基因的甲基化验证
9、样本不同，如何选择DNA甲基化检测技术
易基因结合十余年DNA甲基化研究经验，全面总结了不同样本类型对于不同DNA甲基化检测工具选择的不同，技术推荐标准可以分为三点：
最有力方案（金标准）：WGBS/微量WGBS/scWGBS
最具性价比方案：RRBS/dRRBS/XRBS（动物）
大规模临床转化/目标区域甲基化验证：TBS
10、DNA甲基化数据挖掘
DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
㈤ 相比较于别的甲基化检测技术，易毕恩的羟甲基化检测技术的优势或者说先进性体现在哪呢
DNA甲基化检测采用的重亚硫酸盐检测技术，对DNA有较大的破坏，可能会导致部分甲基化信息的丢失，且所需起始DNA量多，全基因组测序成本很高。此外，单位点DNA甲基化检测目前检测结果偏差，灵敏性和特异性都在70%左右。
而易毕恩的全基因组5hmC（DNA羟甲基化标志物5-羟甲基胞嘧啶）高通量检测技术是在全基因组范围内的捕获及测序，信息全面而完整。5hmC检测技术通过化学捕获法，完成一次检测所需血液量少，低至1ng的DNA输入量即可满足。同时，化学捕获法通过化学结合作用捕获5hmC，检测手段更加灵敏，能够捕获到全面的、基因组范围的5hmC信息。易毕恩收集、检测上万人样本，建立了全球独家的、具备中国人特征的系统数据库，有针对性地对中国健康人群和不同的癌症人群进行系统全基因组信息分析，通过大数据对比找出癌症人群中特异的5hmC信号，并通过机器学习的方法建立模型，独立样本加以验证，数据全面精准，特异性、灵敏度可达双90%。