A. 常用的农药残留分析的步骤有哪些
常用的农药残留分析样品前处理—提取方法 索氏提取法; 加速溶剂提取法; 微波加热提取法; 超临界流体提取法; 固相微提取法; 浸渍、漂洗法; 匀浆法; 消化法; 振荡法; 超声波提取法; 吸附法.
常用的农药残留分析样品前处理——提取方法
内容摘要：索氏提取法加上用分液漏斗的液-液分配技术，长期以来是分析家用来从样品基体中分离靶标分析物的主要技术，将样本放在索氏提取器套管中，在圆底烧瓶中加入提取剂，加热连续提取数小时。现代提取工艺的其他几种方法：加速溶剂提取法，微波加热提取法，超临界流体提取法(sFE)；固相微提取法(SPME)。
样品前处理包括待测物的提取、净化和浓缩。提取是指使用适当溶剂(常用丙酮或乙腈)，将待测物连同样品基质从固态样品中转移到易于净化和分析的液态；净化是指将待测物与提取液中的干扰物质分离。在现代残留农药检测中，提取、净化可一步完成，提取、净化的界限已十分模糊。
一、提取方法
1．索氏提取法
索氏提取法应用将近一百年，加上用分液漏斗的液-液分配技术，长期以来是分析家用来从样品基体中分离靶标分析物的主要技术，将样本放在索氏提取器套管中，在圆底烧瓶中加入提取剂，加热连续提取数小时。此法为经典提取法，也叫完全提取法，是国际上的标准方法，提取效果好，但缺点是用时过长，干扰物质较多，使用过多的有机溶剂。为了减少有机溶剂的用量，缩短提取过程，提取技术朝着小型化、少溶剂的方向发展。近年来出现了一些值得推荐的新的提取技术，如加速溶剂提取法AsE)、微波加热提取法(MAE)、超临界流体提取法(SFE)等，这些方法克服了索氏提取法时间长、有机溶剂用量大的缺点。此外，固相微提取法(SPME)是一种无溶剂、快速而简便的提取技术。
2．加速溶剂提取法
1995年，Richter等提出了一种全新的萃取方法一加速溶剂萃取法(AsE)。该方法是高温(50～200℃)及加压(10．3～13．7MPa)条件下的溶剂提取法。温度高于100℃的溶剂穿透力强且溶解力大，加快分析物从基体解析进入溶剂；加压使溶剂保持液态，用少量溶剂可快速提取固体样品中的分析物。
样品密封在高压不锈钢提取仓内，经过起始的加热过程，样品在静态下与加压的溶剂相互作用一段时间，然后用压缩氮气将提取液吹扫至收集瓶中，每个样品的提取全过程约15min，图6—1是AsE快速溶剂萃取仪示意图。使用快速溶剂萃取仪AsE在数分钟内即可完成常规萃取方法数小时所做的工作，与索氏萃取和微波萃取相比，AsE只需极短的时间，使用最低的溶剂量就可满足各种萃取需求。
现在已有商品ASE自动化提取系统，如I)ionex 200，玻璃样品提取瓶密封于不锈钢圆筒内，24位样品传输架，可以连续自动提取24个样品。提取瓶容量有3种：11mL、22mL、33mL，收集瓶有40mL及60mL两种，每个提取瓶可设置多次提取程序。由于加速溶剂提取法具有以上突出优点，被美国环保局(EPA)推荐为标准方法。
用此系统提取食品中含有的19种有机磷农药，o．1mg／kg，样品5g，提取温度1。0℃，压力10．3MPa，预热5min，静态提取5min，用溶剂快速冲洗样品，氮气吹扫收集全部提取液，加上系统清洗液，总计每个样品用溶剂50mL，耗时20min，过程全部自动化，除甲胺磷和乙酰甲胺磷外，其他17种有机磷农药回收率在80％～90％的范围内，相对标准偏差小于10％。Adou等[M]利用ASE提取，用GC对蔬菜水果中19种农药进行了分析。AsE提取溶剂的选择与索氏提取法一样，提取液同样也需净化才能检测，其作用只是减少提取溶剂用量，缩短提取时间。
3．微波加热提取法
自1986年美国科学家Ganzler等["’首次报道用微波能提取被污染土壤中的有机物以来，微波加热提取法就受到了研究者的注意。微波能是一种非离子辐射，它使分子中的离子发生位移和偶极矩，其中有机物受微波辐射使其分子排列成行，又迅速恢复到无序状态，这种反复进行的分子运动，使样品迅速加热。微波穿透力强，能深入基体内部，辐射能迅速传遍整个样品，而不使表面过热。内部的分子运动使溶剂与分析物充分作用，加速了提取过程，图6—2是微波萃取系统。微波快速溶剂萃取系统可以在15min内萃取12个样品。如MSP一100型微波提取器，同时容纳12个样品，样品提取仓内衬聚四氟乙烯，容量100mL，样品和溶剂置于此密封加压仓内，用微波加热，一般用30～40mL溶剂提取5～20min，加压时提取温度可以高于溶剂的沸点，提取完成后，冷却至室温(约30min)，提取液需净化后分析。
微波提取法的最佳回收率决定于样品基体、靶标农药、提取温度和溶剂。与其他溶剂提取法比较，样品基体的影响较大，而取样量减少并不降低方法的精密度，并且在相同条件下可提取多个样品，增加了样品的流通量。因此针对不同的样品和农药，要预先进行微波参数的优化。Pylypiw等[墙]研究了微波加热提取法对多种田间样品的多残留检测，比较了不同温度、不同提取时间下的提取结果，认为多残留检测最佳条件为：电能置于50％处，温度100℃，提取时间10min，对于百菌清(chlorothalonil)则温度在80℃较好。silgonerL¨j研究表明，用异辛烷、正己烷、丙酮、苯和丙酮(2：1)、甲醇、乙酸、甲醇、正己烷、异辛烷、乙腈等作溶剂，在土壤或沉积物有一定湿度的条件下，微波萃取方法仅用3min，就可获得与soxhlet提取法用6h才能取得的相同的有机氯农药残留回收率。影响密闭容器微波萃取不同样品中农药残留的条件除了溶剂外，还有萃取温度、萃取时间和溶剂体积等条件，经过实验选择最佳萃取条件，萃取土壤中12种农残的回收率结果与常规EPA法进行对照，结果表明微波萃取10min的回收率和精密度均好于EPA规定的索氏法。
4．超临界流体提取法(sFE)
前述的加速溶剂提取法和微波加热提取法采用的仍然是有机溶剂作为提取溶剂，只是加上辅助能源来改善提取。而超临界流体提取法则完全用另一种性质的提取溶剂，即超临界状态下的流体作为提取剂，其中又以超临界二氧化碳应用最普遍。二氧化碳的临界温度31℃，临界压力7．4MPa，此条件比较容易达到。超临界流体黏度小、扩散快，溶质在超I临界流体中扩散速度比液体中快得多，提取过程的质量转移快，因而提取速度快、时间短。改变温度、压力或添加少量的有机溶剂，可以改变超临界流体提取剂的溶解力，这一点优于有机溶剂提取法。解除压力后，二氧化碳成为气态，容易与提取物分离，用少量有机溶剂收集分析物，然后灵活地选择检测方法。二氧化碳惰性、无毒、价格比较便宜是其优势，但只适合于提取非极性及中等极性的分析物(农药)。目前还在寻求其他提取剂，如氯仿是很有吸引力的，它对极性分析物(农药)的溶解力强，可以从含脂肪的样品基体中选择提取靶标农药，图6—3是超临界流体萃取系统与基本工艺流程。
超临界流体可依据具体情况选用COz、水、合成甲醇等介质，制冷剂可选用防冻液或乙二醇等。超临界流体萃取系统包括萃取反应器、介质冷冻／加热循环水浴、介质冷凝液化器、分离器、BPR压力控制、高压计量泵、超高温加热器以及附属空气驱动泵、溶剂泵等。
近来还发现在超临界二氧化碳中添加30％的氮，在80℃及55．2MPa下提取，有机氯及有机磷农药的回收率提高，而脂肪的提取量在可以耐受的水平。
sFE对固体样品是一种好的提取方法，但是需要较贵的超临界流体提取仪才能完成，自动化连续式超临界流体提取仪可以连续提取44个样品，平行式提取仪一般可同时提取6个样品，与索氏法相比，其精密度较好。由于样品基体和农药种类不同，条件选择不一致，对以上3种方法及索氏法而言，各有各的优点，可根据具体分析物的情况定提取方案。
5．固相微提取法(SPME)
水或水溶液中农药的提取，过去一直采用大分液漏斗的液一液分配提取法，费时费力。用固相提取法，大量水样(1L)流过吸附柱，农药吸附在柱上，然后用少量有机溶剂淋洗农药，比液一液分配法已经简化很多。微型固相提取法是固相提取法中的新成员，1989年由加拿大的Belardi和Pawliszyn[21]首先开发，在细石英纤维(170／zm)上涂布一层固定相(吸附剂)，将纤维插入水溶液样品内，水中分析物被分配到固定相上，取出纤维插入气相色谱仪进行分析。微型固相提取法的原理是吸附和热解吸，取样、提取浓缩、进样是一个步骤，全过程无需溶剂，是分析方法上的重大突破。进样不用溶剂，改善了色谱分离效率，纤维可重复使用多次，十分经济。图6—4是自动固相微萃取仪的示意图，固相微萃取特别适用于在进行色谱和质谱分析时，对样品进行微萃取处理。
常用的固定相为聚二甲基硅氧烷(potydimethylsiloxane)，涂布厚度1 0 m，用于提取非极性有机物；聚丙烯酸酯(polyac：ylate)涂布厚度85>m，用于提取极性有机物，有现成的商品供应。sPME—Gc—Ms的检测限可以达到飞克级，分析物转移的随机误差来源少，因而精密度很好，一般RSD小于5％。
Beltran[22]等用SPME—GC—NPD检测环境水中12种有机磷农药(ng／mL)残留，纤维插入3mL水样中(含15％氯化钠)室温下搅拌浸提60mi‘n，然后将纤维插入GC进样口，聚二甲基硅氧烷270℃，聚丙烯酸酯250℃下解吸并分析，该方法的检测限0．01～O．2ng／mL，RSD小于5％。Jacks()n用SPME—GC—PDECD快速测量水中有机氯农药，浸取2min(非平衡提取)，全部分析时间只需10min。
如用顶空取样法，SPME可用于土壤和泥浆样品，加热样品，分析物挥发进入顶空，纤维从顶空取样。目前SPME主要还是用于水或比较纯净的水溶液样品，SPME简便、经济、快速并容易自动化，是一种完全不用溶剂的提取技术，它使样品前处理不再成为方法的瓶颈。
常用的提取方法还有以下几种。
(1)浸渍、漂洗法 将样品浸渍在提取液中，或用提取液漂洗样品。此法对附着在样品表面的农药有很好的提取效果12引。
(2)匀浆法 将样品放在匀浆杯(捣碎杯)中，加入提取剂，快速匀浆(捣碎)几分钟。此法简便，快速，效果好，普遍采用。
(3)消化法 样品中加入消化剂，加热使样品消化，再用溶剂将待测农药提取出。此法多用于不易匀浆，不易捣碎的动物组织样品。
(4)振荡法 在盛有样品的容器中加入提取剂，振荡数小时。此法简便并且提取效果好，较普遍采用。
(5)超声波提取法 样品经粉碎或匀浆捣碎后，加入提取剂，在超声波仪中提取一定时问，此法现已普遍采用。
(6)吸附法 去活吸附剂(硅胶、弗罗里硅土等)混合装柱，再用适当的溶剂将农药淋洗下来，适用于动物组织样品的提取。
B. 蔬菜水果中有机磷农药的残留如何检测
便携式农药残留速测仪及卡片的检测原理和使用方法便携式农药残留速测仪是根据国家标准方法GB/T5009.199 — 2003 )速测卡法(纸片法)而专门设计的仪器.主要用于果,蔬,茶,粮食,水及土壤中有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测,特别适用于农产品质量检测站的快速检测,果蔬生产基地和专业户采摘前田间地头检测,农贸批发销售市场现场检测,酒楼,食堂,家庭果蔬茶加工前安全检测. 检测原理: 仪器的检测原理是利用速测卡中的胆碱酯酶(卡②)可催化靛酚乙酸酯(卡①)水解为乙酸和靛酚,由于有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有强烈的抑制作用,因此,根据显色的不同,即可判断样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况.①② 使用方法:(1)开机 按住面板上的"开 / 关"键约2秒钟,仪器开机(开机后再次按次键可关机):按[模式]键切换至"温度",当温达到40℃时,仪器发出一声提示音,预热完成,可以开始测试.(2)装片 将速测卡撕去上盖膜对折后再展开,插入压纸条下的各通道加热板上(注意卡①一端在上方,卡②一端在下方),检查速测卡放置位置是否正确,速测卡中间的虚线应与压条对齐,不要歪斜.(3)取样 选择有代表性的蔬菜或瓜果皮 ,擦去表面泥土,剪成一平方厘米左右碎片,取5克放入带盖瓶中,加入10毫升纯净水或缓冲溶液震荡50次(有条件拥护可配备超声波清洗器搅拌),静置2分钟以上,每批最好做9个检样,同时做一个纯净水或缓冲液的空白对照,每剪完一个样品,尖刀要洗净后方可处.理另一个样品,以免交驻污染.用移液抢取80微升样品液加到白色药片上. 如果检测是在采样现场或条件简陋的情况下进行,可直接在待检蔬菜叶尖部位滴2-3滴洗脱液,用另一片菜叶尖部在滴液处轻轻摩擦,使蔬菜表面的残留农药充分溶入洗液中.然后滴一滴在(卡②)上.(4)测试 按〈启动〉键,反应开始倒计时10分钟("反应"指示符亮)当听到仪器发出急促的蜂鸣提示音时关闭上盖,显色开始倒计时3分钟("显色"指示符亮):待仪器出缓和的蜂鸣提示音时,打开仪器上盖,进行结果判定.结果判定与空白对照卡比较,若(卡②)不变色或略有淡黄色均为阳性结果,不变黄为强阳性结果,说明农药残留量较高,显黄色色为弱阳性结果,说明农药残留量机对较低.(卡②)变为橘黄色或与空白对照卡相同,为阴性结果.附加说明本方法是生物化学反应,应尽可能避免一些物理和化学因素对酶活性的影响.反应最适酸碱度为PH7.5左右,检样偏酸或偏碱时应改用磷酸缓冲液浸提处理. 反应中,药片表面应保持湿润,最好将每一批样品处理好后统一加样,以免是过长蒸发干. 葱,蒜,萝卜,芹菜,茭白,蘑菇及番茄汁液中含有对酶活性有影响的植物次生物质,容易产生假阳性.处理这类样品时,不宣剪切过碎,浸提时间不宜过长,以免液汁过多释放影响检测检测结果.必要时可采用整株(体)蔬菜浸提的方法进行测定.农药速测卡在常温条件下有效期为壹年,贮存时要求放在阴凉,干燥和避光处,有条件者放于4℃冰箱中最佳.农药速测卡开封后最好在三天内用完,如一次用不完可存放在干燥器中.农药速测卡果蔬农药残留快速检测卡是用对农药高度敏感的胆碱酯酶和显色剂做成的酶试纸,可以快速检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯这两大类用量较大,毒性较高的杀虫剂的残留情况,选用的酶对甲胺磷敏感,抗干扰性强,操作简便,不需要配制试剂,不需要专业的技术培训,可以不需要任何仪器设备单独使用,也可配套农药残留快速检测仪使用,提高检测效率.产品容易贮存,携带方便,是现场检测的最佳方法.