结核菌t细胞检测用什么方法学做

❶ 简述T细胞功能测定的常用方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。1．体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。2．细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。体液免疫检测法1.凝集反应。颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。⑴玻片法：多用于抗原的定性检测。⑵试管法：多用于抗体的定量检测。2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。2．沉淀反应。可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多糖、类脂、蛋白质等。1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩散的沉淀反应。此法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。本法常用于定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。单克隆抗体技术3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。3．中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。4.免疫荧光法（荧光抗体法）。是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目的。包括直接法和间接法。5．酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。6．溶血空斑试验。7．免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)抗体抗原反应创建的DNA印迹术(Southernblotting）基础上发展起来的新型免疫生化技术。细胞免疫检测法近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术，不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。二十一世纪初期，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。1．淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。2000年开始出现一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色成分。该产物的多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪(595nm）测量光密度，作为MTT法的指标。2．E-花环法。人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经37℃培养5～10分钟后放4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞，此法可用来分离T细胞。3．T细胞亚群检测。4．细胞毒试验。Tc细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞等对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。抗体制备常用的检测方法是51Cr（铬）释放法，将51Cr-Na2CrO4盐水溶液与靶细胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如NK细胞的靶细胞为K562），于37℃培养1小时左右，51Cr即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待测细胞毒的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50:1或100:1），靶细胞杀伤越多，释放到上清液中的游离51Cr就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。5．巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药(10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2大小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡，内含巨噬细胞。取水泡液0.5ml加鸡红细胞悬液0.01ml，37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检，计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观察。6．移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因子(MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无MIF产生，以测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。7．时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术(time-resolvedfluorometry,TrF）是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。8．细胞因子检测技术。细胞因子的检测，2005年起在中医临床及实验室中已广泛应用。9．细胞受体的检测。受体是细胞表面标志之一，通过对受体的检测，可以了解细胞的功能，并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。

❷ tspot试验是什么原理

抗原刺激外周血单核产生IFN-γ。

IGRA利用结核分枝杆菌而非牛分枝杆菌BCG株系表达的抗原刺激外周血单核产生IFN-γ。检测结果在血样采集后12至18小时得出，报告结果分为阳性、阴性和不确定。

因为具有高敏感性和高特异性，并且不受卡介苗和大多数非致病分枝杆菌的影响，IGRA在结核诊断中的意义正在被越来越多的临床实验所证实，尤其对于像中国这样普遍接种卡介苗的结核高负担国家，更具有重要意义。

(2)结核菌t细胞检测用什么方法学做扩展阅读：

tspot试验的要求规定：

1、荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3（CR3）结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的粘附与入侵。

2、荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，故结核标本用4% NaOH消化时，一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合。

3、硫酸脑苷脂可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。

❸ 叙述结核杆菌的检验程序

结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。
结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。

一、结核杆菌检验程序
结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。

二、结核杆菌培养特性
1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。
2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。
3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。

三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。
【材料】
1. 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。
2. 抗酸染色液
3. 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。
【方法】
1. 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。
2. 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。
3. 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。
4. 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。
【结果】
1. 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。
2. 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。
3. 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。
4. 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。

四、荧光染色法
此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。

五、结核杆菌毒力试验——动物试验法

【材料】
1. 动物：体重200~250克豚鼠2只
2. 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。
2. 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下0.1ml
3. 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。
4. 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。
5. 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。

六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）
【材料】
结核病人24小时痰液，细口瓶，0.02%酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量0.5%NaOH摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。
2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。
3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。

(二)沉淀法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入0.02%酚红指示剂0.1毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。
2. 矫正PH为7.0，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。
3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。

附录：抗酸染液的配制
1. 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。
2. 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液0.1毫升即成。

❹ 结核菌素的试验方法有哪些

结核菌素试验方法有皮内注射法，皮上划痕法，皮上贴膏法等。

皮内注射法是临床上最常用的一种方法。

（1）皮内注射法：临床上用此方法，如同做青霉素皮试一样，将旧结核菌素稀释液（1 ∶ 1000 或1 ∶ 2000）1ml，注射于左前臂掌侧下1/3，于48 ～ 72 小时看结果，局部出现红晕且有硬结，直径超过5mm 以上者为阳性结果。如怀疑有严重活动性肺结核者，宜用1 ∶ 10000 稀释液，以防局部的过度反应以及可能的病灶反应。注射后48 ～ 72 小时看结果，阴性者用高一级浓度再试，直到1 ∶ 100稀释液为止。

（2）皮上划痕法：与上述相同部位滴旧结核菌素原液1 滴，然后，以消毒的针划破表皮，划痕不超过5mm，若划2 或3 条以上时，划痕间应有1cm 的距离，以有淋巴液渗出为度，但勿使出血，48 ～ 72小时看结果，沿线出现红肿达3mm 以上者为阳性。此种方法，因阳性率低，故不常用。

（3）敷贴试验法：将定量的结核菌素或纯蛋白衍生物（PPD），浸在1cm2 的布上，敷贴在前臂掌面1/3 处，上盖塑料薄膜固定，48小时后除去敷布，再隔48 小时看结果，阳性者局部可有3 ～ 4 个丘疹或小水泡，主要用于婴幼儿。

❺ tbspot结核菌素斑点试验怎么做

结核感染T细胞斑点试验的操作方法是这样的，一般采集10ml左右的新鲜外周血，对标本加入抗凝剂，然后离心机离心分离血清,加入培养基悬浮细胞再加入细胞培养液作为阴性对照，根据实际检查情况出具检查报告。

❻ 结核杆菌用什么方法检测

结核杆菌培养特性 1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。 详细的检测方法生物帮上面有的，蛋白质互作 http://www.bio1000.com/zt/protein/232119.html

❼ 结核病检测新方法 — TB-IGRA

历史上，结核杆菌曾在全世界广泛流行，导致数亿人死亡，被称之为白色瘟疫。从结核杆菌的高感染率、高患病率、高耐药率以及高死亡率这些特点来看，虽然政府对结核病防治有一定的资金投入，但是仍会给结核病患者家庭带来一定的经济压力，因此，结核病还是因病致贫、因病返贫的主要疾病。为了提高民众对结核病的认识，世界卫生组织确定每年3月24日为“世界防治结核病日” 。

TB-IGRA理论依据--T细胞免疫原理

工作原理：机体感染结核杆菌以后，存于血液中的特异性淋巴细胞会在再次接触结核杆菌特异性抗原时，产生和分泌相应的细胞因子干扰素g。通过对该细胞因子的定量检测，可以对疾病的感染状况进行判断。判断机体被结核杆菌感染的风险。根据这个原理，选取存在于结核杆菌，但在卡介苗和大多数非结核杆菌中普遍缺失的RD1区编码的ESAT-6和CFP-10作为结核杆菌特异性抗原，与新鲜采取的肝素钠抗凝全血或者PBMC(外周血单个核细胞)充分混合孵育后，应用酶联免疫法或者免疫斑点法检测特异性g-干扰素的释放。结果不受卡介苗干扰，提高了结果的特异性。

TB-IGRA应用现状：
IGRA技术是国际最新的用于结核杆菌感染的体外免疫诊断方法;

在北美、欧洲和日本已被广泛应用于结核杆菌感染的检测，包括结核病辅助诊断; 高危人群筛查;公共卫生突发事件;体检等(含不孕不育人群);

美国和日本已经将该技术写入该国用于结核防治的指导原则中。

适应人群：

lindalex's blog