检测肺孢子菌的染色方法

‘壹’ 肺部真菌感染的诊断

肺部真菌感染临床表现无特异性，诊断根据侵袭性肺真菌病分级（3级）诊断标准，分为确诊、临床诊断、拟诊。确诊只需具备组织学或无菌体液检测确定的微生物学证据（涂片和培养），不涉及宿主因素。临床诊断需综合考虑宿主因素、临床特征、微生物学证据3部分。拟诊是符合宿主因素、临床特征，缺乏微生物学证据者。免疫学检测血清中细胞壁成分（1，3）-β-D-葡聚糖抗原检测（G试验）、半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）阳性有重要的辅助诊断价值。以下介绍几种常见肺部真菌感染的诊断：
1.肺念珠菌病
见于粒细胞缺乏、中心静脉留置导管、腹部大手术、激素和抗生素治疗、糖尿病、肾功能不全、器官移植等高危人群。临床症状有不能解释的持续发热、呼吸道症状，但体征轻微。咳嗽，甚至剧咳，咳少量白色黏液痰或浓痰。血型播散型常出现迅速进展的循环和呼吸衰竭。X线呈支气管肺炎改变或片状浸润或融合，可有空洞形成。下呼吸道分泌物、肺组织、胸水、血直接涂片或培养出念珠菌即可确诊。痰液直接涂片或培养出念珠菌并不能诊断为真菌病，因有10%～20%的正常人痰中可找到白色念珠菌，若3%双氧水含漱3次从深部咳出的痰（合格痰）连续≥2次培养出同一菌种的念珠菌则有诊断参考价值。血培养念珠菌阳性是念珠菌菌血症可靠的诊断证据。部分患者G试验阳性（需除外假阳性），可为临床诊断提供重要参考。
2.肺曲霉病
临床表现复杂，常见3种类型：过敏性支气管肺曲霉病（多见过敏体质）、曲霉球（最常见症状是咯血）和侵袭性肺曲霉病（为粒细胞缺乏或接受广谱抗生素、激素、免疫抑制剂治疗过程中出现不能解释的发热、干咳、胸痛，咯血等）。过敏性支气管肺曲霉病诊断标准包括：
（1）反复哮喘样发作；
（2）外周血嗜酸粒细胞增高≥1X109/L；
（3）X线一过性或游走性肺部浸润；
（4）血清总IgE浓度≥1000mg/ml；
（5）曲霉抗原皮试阳性；搜汪胡
（6）血清沉淀素抗体阳性；
（7）特异性抗曲霉IgE和IgG滴度升高；
（8）中央囊状支气管扩张。
肺曲霉球根据影像学特征可作出临床诊断，但需与其他真菌球、错构瘤、肺癌、棘球蚴囊肿、肺脓肿相鉴别。确诊需病原学和组织病理学。肺曲霉球CT特征为肺空洞或胸膜腔内圆形致密阴影，其边缘有透光晕影。若空腔较大，尚可见球形阴影有蒂与洞壁相连，形如钟摆，球形阴影可随体位变化而改变形态。如果空洞较小，球形病灶填充了大部分空腔，其晕影很小，仅呈一狭长的半月形透亮带。侵袭性肺曲霉病CT特征：早期为炎症阴影，周围呈现薄雾状渗出（“晕轮征”），随后炎症病灶出现气腔实变，可见支气管充气征，再后可见病灶呈现半月形透光区（“空气半月征”），进一步可变为完整的坏死空洞。其诊断采用上述提到的3级诊断标准。GM试验阳性提供重要参考。
3.肺隐球菌病
隐球菌中具有致病性的主要是新生隐球菌及其变种（目前至少有9种）。临世拦床症状和体征：从无症状到急性肺炎表现，差异甚大，无特异性，合并脑膜炎者可有头痛、头晕、呕吐等脑膜刺激征。
影像学表现：结节或团块状阴影较为常见，占40%～60%，单发或多发，见于一侧或双侧肺野，常位于胸膜下，大小不一，直径1～10cm，边缘光整，也可表现为模糊或有小毛刺。常有空洞形成洞壁比较光滑，早期可在呈现结节性密度影中有均匀一致、非常规整的低密度区。结节或团块伴光整的低密度坏死或空洞对肺陵州隐球菌肺病有重要的参考价值，特别是呈多发性时，此种征象多见于免疫机制健全的患者；肺实质浸润占20%～40%，单侧或双侧，与其他病原体肺炎难以区别，多见于免疫功能低下患者；弥漫性粟粒状阴影或肺间质性病变比较少见，可发生在AIDS患者；胸腔积液较少见，一旦出现，抽取积液进行病原体检查有重要诊断意义。
病原学和组织病理学检查：①痰和下呼吸道采样培养阳性率不高，特异性低，但在AIDS或其他免疫抑制患者仍有参考价值。②抗原检测：多糖抗原检测隐球菌荚膜特异性高。肺隐球菌病患者血清抗原检测阳性率<40%，因此提倡应用BALF和胸腔积液送检。③组织病理学检查：凡有条件者应采用经皮或经支气管肺活检，进行病理组织学检查。在肉芽肿或胶冻样病灶见到典型的有荚膜、窄颈、芽生但无菌丝的酵母型菌，有确诊意义。在无宿主因素而影像学提示本病可能时尽可能通过经皮或经支气管肺活检确诊，以避免不必要的手术。
4.肺孢子菌肺炎
本病绝大多数见于艾滋病患者和其他原因的细胞免疫抑制患者。发热、干咳和渐进性呼吸困难、低氧血症是本病主要临床症状。即使肺内出现大片炎症改变，但体征很少。影像学上早期呈弥漫性肺泡和间质浸润性阴影，迅速融合而成为广泛肺实变，可见支气管充气征。一般不累及肺尖、肺底和肺外带。如患者持续发热>96小时，经积极的抗生素治疗无效；同时具有肺部感染的症状及体征：咳嗽、咳痰、咯血、胸痛和呼吸困难及肺部啰音或胸膜摩擦音等体征；影像学检查可见除主要临床特征之外的新的非特异性肺部浸润影需考虑该诊断。咳痰、导痰、支气管肺泡灌洗标本或肺活检标本仍是本病的基本诊断方法。

‘贰’ 常用微生物染色的方法

革兰染色

抗酸染色:分支杆菌属,诺卡放线菌属。石炭酸复红染色,金永染色。

芽孢染色:用于区分细菌的芽孢和营养细胞。结果芽孢染成绿色,营养细胞为红色。

晶体染色:观察苏云金杆菌不同变种的晶体形状大小。结果晶体染成紫色,芽孢为透明椭圆形,仅见具有轮廓的折光体。

鞭毛染色:有赖夫生染色法、银盐染色法,西萨-基尔染色法等。一般以西萨-基尔(Cesares-Gill)染法效果最佳。

异染颗粒染色:用于白喉棒状杆菌染色,直接涂片或改良阿伯特法染色。

墨汁荚膜染色:观察菌体有无荚膜,如新型隐球菌。碳素墨汁。

镀银染色:螺旋体

吉姆萨染色:螺旋体

荧光染色

魏申染色(wayson)染色:鼠疫耶尔森杆菌。

铬酸P、A、S真菌类染色。结果:曲霉菌、念球菌属、细胞浆菌属、隐球菌属为红紫色。曲霉菌丝周边紫红色,弹力纤维紫色,背景绿色。

Mann氏甲基蓝伊红染色法:病毒包涵体染色。Negri氏小体红色。

Nacchiavello氏染色:病毒包涵体染色。结果:包涵体、立克次氏体均染红色,其余组织呈蓝色。

Crocott-Gomori氏六胺银法:新型隐球菌

碘染色法吉姆萨染色:衣原体

乳酸酚棉蓝染色,糖原染色:真菌,前者适用于所有真菌,呈蓝色。

吉姆萨染色,瑞氏染色:鞭毛虫,滴虫,锥虫,疟原虫,弓形虫,隐孢子虫等原虫。

三色染色,碘染色:阿米巴等原虫。

荧光素吖啶橙染色:疟原虫。

金胺-酚染色:隐孢子虫。

甲苯胺蓝,四胺银染色:耶氏肺孢子虫。

‘叁’ 生物中检测微生物用什么意思方法

生长量测定法

体积测量法：又称测菌丝浓度法。
通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

称干重法：
可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在1050C或1000C下烘干，或采用红外线烘干，也可在800C或400C下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在400C下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

比浊法：
微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。

菌丝长度测量法：
对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。

微生物计数法

血球计数板法:
血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

染色计数法：
为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

比例计数法：
将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

液体稀释法：
对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

平板菌落计数法：
这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

试剂纸法：
在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

膜过滤法：
用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

生理指标法：
微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。

测定含氮量：
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

测定含碳量：
将少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

还原糖测定法：
还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。

氨基氮的测定：
方法是，离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02N的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。

其他生理物质的测定：
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸，产气，产CO2（用标记葡萄糖做基质），耗氧，黏度，产热等指标， 都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如我所在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。

商业化快速微生物检测法：
微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：
1、抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。中科院广州分院合作产业处提供的抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。
2、BACTOMETER 全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。

‘肆’ 嗜肺军团菌的鉴别要点

您好

嗜肺军团菌是一种有鞭毛，革兰氏阴性，军团菌属多形态性的短小球杆菌。二名法 Legionella

pneumophilaBrenner DJ, Steigerwalt AG, McDade JE 1979

1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病，经

嗜肺军团菌

是尿素，同时，不可参加酵解反应。嗜肺军团菌无色，也非自身荧光。氧化酶与过氧化氢酶测试阳性。β-内酰胺酶阳性。

专性需氧，在自然界可长期存活，如在蒸馏水中可存活139天，自来水中可存活369天，对热和一般消毒剂敏感。菌落特征为灰白色，有光泽，湿润，圆形，凸起，并有特殊臭味。革兰氏染色不明显，多用镀银法或Giemsa法染色。[1]

‘伍’ 微生物检测手段及注意事项

1. 微生物计量法

1.1 体积测量法

又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液(如10 mL)放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间(如5 min)和转速(如5000 rpm)，离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

1.2称 干重法

可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

1.3 比浊法

微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600 nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.coli的生长及诱导时间。

1.4 菌丝长度测量法

对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。

2. 微生物计数法

2.1 血球计数板法

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1 mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2 染色计数法

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

2.3 比例计数法

将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4 液体稀释法

对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5 mL试样，接种1 mL到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN(Most Probable Number)得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5 平板菌落计数法

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9 cm的平板上出现50~500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的'细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

2.6 试剂纸

在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7 膜过滤法

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

3. 间接测定法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。

3.1 测定含氮量

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

3.2 测定含碳量

将少量(干重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加热30分钟后冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

3.3还原糖测定法

还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。

3.4 氨基氮的测定

离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02 mol/L的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02 mol/L的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。

3.5 其他生理物质的测定

P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸，产气，产CO2(用标记葡萄糖做基质)，耗氧，黏度，产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。

4. 商业化快速微生物检测法

微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：

4.1 试剂盒，培养基等手段

抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如：抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。

4.2 借助新型先进仪器

BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(Impedance Technology)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是Optical Density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是：505 nm测菌丝菌体、560 nm测酵母、600 nm测细菌。用测OD方法画微生物生长曲线时，同一株菌的起始培养浓度可以准备多管(根据检测点的需要，如需检测10个点，就准备10管)，然后每个点取一管出来测OD值就行了。

一般测菌体密度的OD的波长范围是580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌用600 nm，已经属于可见光区(200 nm～400 nm为紫外光区，400 nm～800 nm为可见光区)。空白如用水做，需要离心洗涤菌体;空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤，但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在这个区内的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀释后再测，因为OD太大，分光光度计的灵敏度就会显着降低。

一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。

另，用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600 nm

这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600 nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌，其实在400多纳米处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰。