酪蛋白酶活性检测方法

1. 蛋白酶的酶活力测定实验报告后的问题.......求高人解答！！！！急！！！！！

一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。

二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。贺举

三、

胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；

要在酶的最适温中拍歼度40℃下反应；

要在酶的最适PH为7.5调节下反应；

催化反应的时间控制精确；

向1号试管加入三氯卖冲醋酸时要快；

加入各种药品的量要精确，特别是酶；

2. 3.国际酶活力单位与习惯酶活力单位的区别是什么

酶活力：酶催化某一化学反应的能力，用单位时间内产物的增量或底物的减少量表示。
酶活力单位：酶催化能力大小的量度
国际单位（IU）：在规定条件下每分钟内催化1μmoL 底物转化的酶量 为一个酶单位，1μmoL变化量 / 分钟
Katal（Kat）：在最适条件下，每秒钟内转化1moL底物所需的酶量，1moL变化量/ 秒
习惯单位（U）：底物(或产物)变化量 / 单位时间。
酶的比活力：每毫克蛋白质所含的酶活力单位数，酶纯度的量度
实验方法
Folin-酚比色法测定酪氨酸含量：在碱性条件下，酪氨酸可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物），蓝色的深浅与酪氨酸的含量成正比。
凯氏定氮法测蛋白质含量：理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~19%),因此，通过测定物质中的稿郑含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即: 蛋白质含量=含氮量/16%。
解析：
（1）1ml酶液中猛敬仿蛋白的含量及活力单位。
由“称取25mg的蛋白酶粉配制成25mL酶液”可知酶液的浓度为1mg/mL；
由“另取2ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2mg”可知1ml酶液中蛋白氮的含量为0.2÷2=0.1mg;
根据凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量＝蛋白氮含量×6.25（即蛋白质平均含N量为16％），可枝纤计算出：
1ml酶液中蛋白含量 = 0.1mg×6.25 = 0.625 mg
由“取出0.1ml，以酪蛋白为底物用Folin-酚比色法测定酶活力，结果表明每小时产生1500μg酪氨酸”，根据酶活力单位的定义，可计算出：
1ml酶液中酶活力单位=1500ug÷60min÷0.1ml=250U
（2）酶比活力。
由（1）的计算结果可知，1ml酶液中蛋白质含量为0.625mg，酶活力单位为250U，则：
酶的比活力为250U÷0.625mg=400U/mg蛋白
（3）1g酶制剂的总蛋白含量及总活力。
由（1）知酶液浓度为1mL酶液(1mg/mL)中蛋白质的含量为0.625mg，则：
1g酶制剂总蛋白量=0.625mg×1000=625mg
总活力=400×625=2.5×105U

3. 测定碱性蛋白酶活有哪些方法

碱性蛋白酶酶活力检测方法

酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。

碱性蛋白酶酶活测定原理 福林法原理

碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（Folin)（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力，以此计算其酶活力。

酶活力测定实验步骤

酶液制备：精确称取干酶粉1g（±0.001），加入10mL缓冲液（2.2.5），在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静置片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲液定容至刻度，充分摇匀，用四层纱布过滤。吸取滤液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液位稀释2000倍的酶液。（稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活）

酶活定义

碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位。

酶活力测定注意事项

1、酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响，因此必须严格控制。

2、用三氯醋酸终止反应后，过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。

3、因为Folin试剂对酸性环境比较敏感，容易发生变化，因此在测定时有顺序的规定，需要先加入碳酸钠溶液形成一个碱性环境，之后再加入Folin试剂，使其能正常发挥作用

4. 为什么在测酶活时,酪蛋白和酶的反应时间必须精确

保证在酶的稳定反应状况之下获取可比数据。
测酶活力尺亩常用其催化某一化学反应的能力来表示。在酶活力测定中酪蛋白和酶的反应时间要控制严格一致，使之槐困启均处于线性范围和稳定的初速度之中，以保持两组数据之间铅如稳定的相关性和可比性。
酶活力也称为酶活性，测量酶活力的原因是测定酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。

5. 测蛋白酶活性为什么很多都用casein做底物

酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质。牛奶的蛋白质，主要以酪蛋白(Casein)为主，人奶以白蛋白为主。酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳(curds)。
酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素(Ca、Mg)与微量元素(Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se)高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收，所以CPPs是最有效的促钙吸收因子之一，它的发现为补钙制品的研发提供了一种新方法。目前，CPPs已被公认为国内外研究最多、最深入，应用领域极为广泛，且极具开发价值的一类分子结构与生物功能间有明确对应关系的活性多肽物质。
酪蛋白为非结晶、非吸潮性物质，常温下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶于25℃水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分，当浸入水中则迅速膨胀，但分子不结合。
物化性质：
干酪素是等电点为pH4.6的两性蛋白质。在牛奶中以磷酸二钙、磷酸三钙或两者的复合物形式存在，构造极坦旦为复杂，直到现在没有完全确定的分子式，分子量大约为57000-375000。干酪素在牛奶中约含3%，约占牛奶蛋白质的80%。纯干酪素为白色、无味、无臭的粒状固体。相对密度约1.26。不溶于水和有机溶剂。干酪素能吸收水分，浸于水中，则迅速膨胀，但料子并不结合。
制备方法：(1)新鲜牛奶脱脂，加酸(乳酸、乙酸、盐酸或硫酸)，将pH调至4.6，使干酪素微胶粒失去电荷而凝固沉淀。用这种方法得到的干酪素称为酸酪蛋白，加酸的种类不同得到的酸酪蛋白却几乎毫无区别。酸酪蛋白是白色至淡黄色粉末或颗粒，稍有奶臭和酸味。在水中只是溶胀，若加入氨、碱及其盐时，则可分散溶解于水中。可溶于强酸、二乙醇胺、吗啉、尿素、甲酰胺、热苯酚和土耳其红油。(2)将牛奶与粗制凝乳酶作用，形成凝固沉淀物，称为粗制凝乳酶酪蛋白，呈白色粒状，几乎无味无臭，加热灼烧会产生特有的臭味。凝乳酶酪蛋白比酸酪蛋白的灰分含量高。
用途：酸酪蛋白主要用作涂料的基料，木、纸和布的粘合剂，食品用添加剂等。作为涂料的基料约占总消费的一半，具有优良的耐水性，在颜料中能很好地分散，提高涂料纳信拆的均匀性。此外，因流动性好，易于涂装施工，粗制凝乳酶蛋白主要用于制造塑料钮扣。酪蛋白钮扣与其他树脂钮扣相比，染色性、加工性、色泽鲜艳性均好，质量洞枣在钮扣中居中上等。干酪素与消石灰、氟化钠、硫酸铜均匀混合，再配入煤油得到酪素胶，是航空工业和木材加工部门使用的一种胶合剂。干酪素也用于医药和生化试剂。

6. 偶氮酪蛋白测蛋白酶活性标曲怎么设

偶氮酪蛋白测蛋白酶活性标曲这样设。具体方陵告法是：
1、将亏困粉末状的底物（2g）放入l20ml烧杯中，加入4ml乙醇或工业甲基化酒精（IMS）。
2、用磁力搅拌器充分混合，打碎所尺空明有的块状底物。
3、然后加入96ml磷酸钠缓冲液(100mM.pH7.0；BufferA)，再次充分搅拌直到底物全部溶解。
4、用玻璃棒驱散任何粘住烧杯边缘的偶氮酪蛋白，溶解完全的溶液保存于可密封的容器中。
5、加入2滴甲苯以防止微生物的wu染，4C下保存，可以保存数周。

7. 蛋白质磷酸化的蛋白磷酸激酶的纯化与活性分析

蛋白磷酸激酶是能催化磷酸基团从磷酸供体转移到受体蛋白的酶，通常ATP的γ位磷酸(或其它三磷酸核苷)为供体。国际生物化学联合会根据受体氨基酸的特异性，将蛋白激酶分为以下几类：①以蛋白乙醇基作为受体的磷酸转移酶称为蛋白丝氨酸或苏氨酸激酶;②以苯基为磷酸受体的磷酸转移酶称为蛋白酪氨酸激酶;③以His，Arg或Lys为受体的磷酸转移酶称蛋白His激酶;④以Cys残基作为受体的磷酸转移酶称蛋白Cys激酶;⑤以乙酰基作为受体的磷酸转移酶称天冬或谷氨酰胺激酶。
前两类酶最常见，许多蛋白丝/苏氨酸或酪氨酸激酶已被纯化。利用分子生物学技术，已克隆出100多个蛋白激酶的基因。有些已通过测定其核苷酸序列而推出其相应的氨基酸序列。在很多情况下，克隆的酶基因产物氨基酸受体特异性不能被直接测定，一般是通过序列分析与已知特异性的蛋白激酶比较而得出。所有已知的丝/苏和酪氨酸蛋白激酶都有一个共同的催化结构域(约270个氨基酸)，通过催化结构域的序列同源性比较，可将蛋白酪氨酸激酶家族分成若干亚家族。蛋白丝/苏氨酸激酶家族较酪氨酸激酶家族大。此外，还有许多有关His，Lys和Arg特异性磷酸化酶活性的报道，但这些酶未被纯化，其分子结构也不清楚。(一)蛋白磷酸激酶的纯化
蛋白激酶的纯化分微量纯化和大量纯化两种，前者通常应用在特殊条件下培养的细胞，后者一般应用于特殊的组织器官。微量纯化的优点是克隆化的细胞株具有均一的细胞类型并处于同步的细胞周期，细胞内成分可被放射性同位素特异标记，在细胞培养时加特殊因素可研究细胞内某些感兴趣的途径。缺点是原料少，纯化出的蛋白量有限。 ，通常选用惰性系统，如Pharmacia的FPLC系统。该系统的优点是具有很大的内在惰性，并具有保持大分子生物活性的特点。该系统在一个单元内含有单一的硬件，可在冷室和室温操作。此外，可采用快速的梯度(40～45分钟)形式和较广适用范围的高效凝胶和柱系统。这是因为在此条件下多数蛋白质不与树脂结合，包括能使激酶失活的磷酸酶。然而，许多激酶尽管其表现等电点≤5.5，但在中性条件下仍可与MonoS结合，这可能是由于其磺酸基与ATP或底物分子结构有些类似。大体积抽提物可用泵直接进样，并进行连续两次的离子交换分离。FPLC预装的凝胶排阻柱可在30分钟内完成分离，较传统凝胶快得多。但由于柱填料粒度小，上样体积不超过200μl，样品量不超过5～10mg，纯化量较小有些性质难以鉴定，因而需多次纯化。Pharmacia引入一种新的介质(Sephacryl HR)较传统的超细胶流速快5倍，这些凝胶在很大程度上减小了凝胶过滤色谱的时间。在完成亲和纯化后，酶的纯度可用SDS-PAGE检测并定量测定其比活性。(二)蛋白磷酸激酶的活性分析蛋白激酶活性分析分为两步：①末端标记的三磷酸核苷核供体(通常是ATP，有时用GTP)中的磷酸基团转移到蛋白质或肽底物上;②将磷酸化的底物分离出并进行定量分析。前者通常在溶液中进行，酶和底物均在液相中。后者为了去除游离的标记核苷酸，通常需要用三氯醋酸沉淀、SDS-PAGE分离或使标记底物结合于纤维素膜上。有时可将酶或底物固定于固相载体上，如蛋白质混合物经SDS-PAGE后转移到硝酸纤维素膜上，然后封闭，放入含有酶和标记ATP的溶液中。或者更进一步，设计一个蛋白激酶分析系统(酶活性的原位分析)，将蛋白激酶和它的底物均固定于硝酸纤维素膜上，这一方法可与标准的液相分析方法达到相等的灵敏度和线性范围。其分析原理是含有蛋白激酶活性的样品先固定于硝酸纤维素膜上(点滴或真空抽吸)，然后将滤膜浸入合适的蛋白底物溶液中，底物蛋白质与剩余的膜结合位点结合，然后加入同位素标记的ATP，作用一定时间后洗去膜上未反应的ATP并终止反应，参入物经放射自显影或液闪计数定量，与膜结合的酶和底物均具有一定的运动性，两者反应的定量值代表磷酸化的程度。以酪蛋白激酶Ⅱ的活性测定方法为例：试剂：缓冲液A25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，100mmol/LNaCl，pH8.0缓冲液B25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，200mmol/L NaCl，10%甘油(V/V)，1mmol/L DTT，pH8.0酪蛋白激酶Ⅱ底物水解或部分脱磷酸的酪蛋白10mg/ml溶解于缓冲液A中。酪蛋白激酶Ⅱ反应混合物25mmol/L Tris，pH8.5，100mmol/L NaCl，10mmol/LMgCl2，1mmol/L DTT，0.1μmol/L〔V-32P〕ATP(100Ci/mmol)操作步骤：
1.剪一适当大小的硝酸纤维素膜并划成25px大小的方格;2.用缓冲液A浸湿膜并放于一用同样缓冲液浸湿的滤纸上，使膜平坦;3.用缓冲液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)将样品稀释到合适的浓度，膜上每个点所加的样品其激酶活性在0.5～50pmol单位(1pmol单位代表每分钟转移1pmol 32P的酶量)，当酶比活性在1μmol/min·mg-1时则每个点应加纯酶0.5～50ng; ，待液滴消失后将膜面对含有缓冲液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(贴于玻璃平板上)，在湿润环境中23℃作用30分钟。大片膜可密封于塑料袋中;5.在100ml缓冲液A中洗膜并置于一新的Parafilm膜上(加有反应混合物溶液25μl/cm2)，23℃作用5～30分钟;6.用缓冲液A 100ml洗膜4次，空气干燥后进行放射自显影。或切成方块进行液闪计数定量。
该方法在应用时最常见的问题是硝酸纤维素膜过载(指总蛋白或酶活力单位)。硝酸纤维素膜结合BSA的线性范围可达50μg/cm2(相当于每斑点5μg)，而结合容量可达500μg/cm2，如果样品本身造成蛋白质超载，则应降低稀释液中的BSA浓度。同时应注意不要加过量的酶，因为超过50pM单位即超过了该方法的线性范围，并可能影响硝酸纤维素膜邻近斑点的检测。该方法用于其它蛋白激酶检测时应适当变换测定条件。因蛋白激酶活性的斑点印迹方法与标准的液相方法在灵敏度、检测范围、线性等方面相当，所以可以代替后者进行常规检测。也在天然凝胶电泳和转移电泳后分析蛋白激酶活性的分布，可用于分析酶在不同发育阶段各组织表达的变化、cDNA克隆分析和突变体分析。

8. 什么是酶活力测定的终点法此法有何优缺点

酶活力测定常用的方法有终点法和动力学方法两类。
终点法
测定完成一定量反应所需的时间，如α-淀粉酶的活力测定。因为碘对淀粉呈现蓝色反应，当淀粉溶液中加入淀粉酶后，碘的蓝色反应消失而呈现红棕色；碘对淀粉颜色反应消失的时间可表示淀粉酶活力的大小。碘对淀粉颜色反应消失花的时间越短，表示酶的活力越高。
动力学方法
测定一定时间内所起的化学反应量。
①比色法 如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生成稳定的有色溶液，且生成颜色的深浅与产物的浓度在一定的范围内有线性关系可用此法。如蛋白酶的活力测定：蛋白酶可水解酪蛋白，产生的酪氨酸可与福林试剂反应生成稳定的蓝色化合物，在一定的浓度范围内，所生成蓝色化合物颜色的深浅与酪氨酸的量之间有线性关系，可用于定量测定。
②量气法 主要用于有气体产生的酶促反应。如氨基酸脱羧酶、脲酶的活力测定。产生的二氧化碳量可用特制的仪器如瓦氏呼吸仪测定之。根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应的速度。
③滴定法 如果产物之一是自由的酸性物质可用此法。如脂肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。
④分光光度法 利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
⑤放射测量法 是酶活力测定中较常用的一种方法。一般用放射性同位素标记底物，在反应进行到一定程度时，分离带放射性同位素标记的产物并进行测定，就可测知反应进行的速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲酶，将底物尿素用14C标记，产生的带放射性的CO2气体可用标准计数法进行测定。
⑥酶偶联分析 某些酶本身没有合适的测定方法，但可偶联另一个酶反应进行测定。其基本方法为：应用某一高度专一性的工具酶使被测酶反应能继续进行到某一可直接连续且简便准确测定阶段的方法。如：被测E1反应的产物B是某一脱氢酶(E2)的底物，向反应体系中加入足量的脱氢酶和NAD+或NADPH+，使反应由A经B继续进行到C，然后测定NADH或NADPH的特征吸收光谱的变化，即可间接地测定E1的活力大小。如己糖激酶的活力测定即应用这一方法。注意：使用该法要求指示酶必须很纯，且具有高度的专一性，以免干扰反应而给测定带来麻烦。

9. 怎样检测蛋白酶活性

在适宜条件下(温度,pH),加入蛋清,若消失则有活性.

10. 如何测定微生物酶活性

看是什么酶了，比如我们做过的蛋白酶就是：
样品管处理：吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置于试管中，在40℃水浴中预热5分钟后加入同样条件下预热好的酶液1 mL，立即计时。反应10分钟后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3 mL，室温下放置15分钟后，4℃、6000转/分离心10分钟。
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对照管处理：同时另作一对照管，即取酶液1 mL，先加入3 mL10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%的酪蛋白溶液2 mL，40℃水浴中保温10分钟，室温放置15分钟，4℃、6000转/分离心10分钟。
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显色：取3支试管，编号。分别加入样品处理及对照处理上清液和水各1 mL，然后各加入0.55mol/L的碳酸钠溶液5 mL，混匀，立即加入Folin试剂1 mL，立即混匀，40℃水浴中显色15分钟。
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吸光度测定：以加水的那一管作为空白，测定样品及对照在680nm下的吸光度A680。

希望有用