㈠ 凝胶渗透柱层析
凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，1.凝胶颗粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络图1、凝胶渗透层析原理示意图内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。
凝胶层析的关键在于建立液固相平衡，然后以合适的洗脱速度将不同物质分离流出。温度高有利于快速建立液固相平衡。但是，温度高也造成溶质在液体中会扩散太快，导致分离效率降低。
目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分，这包括对有机合成产物的纯化、天然产物的分离纯化
㈡ 色谱柱柱效如何检测
判断色谱柱柱效下降可以通过以下几个途径：
1.看峰分离度怎么样，分离度直接关系测试结果准确性，可以判断柱效是否下降，柱效下降分离度一般会变差。
2.通过谱图峰型的变化，是否有严重前伸和拖尾现象，峰型是否规则来看，如果峰型很差了，柱信激效已经下降了，可以及时采用乙腈和甲醇等溶剂进行修复。
3.通过压力变化和出峰时间来判断，一般柱迟坦蚂效下降时伴随着柱压的升高和降低，此时出峰的时间也会和之前有很大差异。
4.还可以根据新的柱子的保留时间判断,看重复性,平行性如何码埋.
1)
保留时间变短；
2）理论塔板数降低；
3）峰对称度变差；
4）分离度减小。
㈢ 蓝色葡聚糖 葡萄糖凝胶柱
1.凝胶的预处理
交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
2.装柱
层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍察孙。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。
3.加样与洗脱
（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。样品体积过大，分离效果不好。
对高分辨率的分子升没差筛层吵皮析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。
（2）加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。
（3）洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。
凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9～8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
凝胶再生和保存
凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用，因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分离操作。但使用多次后，由于床体积变小，流动速率降低或杂质污染等原因，使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理，其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分离。
对使用过的凝胶，若短时间保存，只要反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适量防腐剂即可；若长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥等处理后，装瓶保存。
㈣ 为什么要柱效检测具体步骤怎么弄要详细步骤和运算
固定柱床层析是一种多功能的分离技术，常用于生物医药的分离中。
无论是在保证纯化过程的稳定性穗蠢还是保证最终产物的安全性上，填充柱的制备和质量认证都是极为重要的猜正陪步骤。
即使柱效检测不能作为单一参数对后期的纯度和回收率进行预测，至少在启动纯化工艺前可作为一种快速途径对层析柱和设备性能进行检测。所以需要检测柱效。
1，系统准备
对系统和管道进行润洗准备
清除在包装、储存或运输过程中累积在管道和分流系统中的空气
将层析柱置于1.5 柱体积以上的洗脱液中进行平衡。若柱平衡在盐溶液中进行，则需要保证出口的电导和入口的电导一致。平衡时的液流方向需与测试时一致。测试方向既可向上流也可向下流。
2，运行脉冲柱效检测
将提前准备好的一定体积的样品（1%柱体积）加载于柱上，上样最好采用样品环，超级容量杯或样品泵。
3，通过测定峰宽和对称性评价
相对峰宽通常用一定数量的理论塔板（N），
一个理论塔板的等价高度（HETP）
颗粒半径 （d/P）清衫
或更常用折合了的塔板高度（h）来进行描述：
h=HETP/d/P 对称性As
对称因子As 描述了与理想高斯峰形状的偏差，通过对10%
峰高处的峰宽进行计算得到：
As=b/a