‘壹’ 基因表达谱分析方法
表达谱案例分析
肺癌组织的表达谱分析：选取 2 个肺癌病人（ 5T 和 10T）的组织提取总 RNA，进 行分析。
实验目的：为了检测两个病人中表达差异较大的基因， 以便找出两个病人症状差 异的原因，并进行下一步相关的研究。
1、 数据质量的概述
通过严格的质量标准筛选后， 通过率达到 80%，最终得到 500 万左右的 Tag标签。
2、 标签的初步分析统计
两个样品中有 95%的 Tag重复频度超过 1，73%以上的 Tag重复频度超过 50。
3、 表达谱测序饱和度分析
通过对表达谱测序饱和度的分析，通常在表达谱 Tag数目达到 200 万时，测序 Tag接近饱和。因此，通过 Solexa 测序，仅需要 1次试验，就可以得到足够后 续进行表达分析的数据。
4、 样品重复性。
5、 Tag 标签的注释（含 cDNA，预测基因， EST，线粒体基因组，基因组等）
本案例中，人的 2 万 7 千个基因中有 50~60%都被 Tag所覆盖。即一般的基因的 表达量差异被检测出来。 为了提高 Tag同基因关联的可信度， 我们仅仅选取了在 基因序列中唯一定位的 Tag。这部分唯一定位的 Tag占全部 Tag数目的 50%左右。
另外，除去上述用于基因表达量统计的唯一定位 Tag，有大约 20%的 Tag 被定位 到了基因组的未注释区域， 其中大约有 10万个 Tag在基因组上的位置是唯 一的。 利用这些数据我们找到了许多新的转录本和调控区域。 同时发现了若干潜在的两 个样品间显着差异的区域。为后续的实验提供了可靠的研究目标。
6、 参考 Tag标签的统计分析
下表显示的人的参考 Tag 的统计信息，我们可以看到 96.53%的基因都拥有 Tag。 说明 Tag-based 新一代测序技术的方法进行表达谱分析的可行性
7、 基因表达量的分布统计
8、 样本间表达差异基因的相关分析
通过对表达差异基因的统计和分析，我们可以选取样品间表达存在差异的基因， 反馈给用户； 此外一些已经报道可能相关的基因， 是这一部分研究的重点， 通过 表达差异，我们可以推测出相关基因可能发生的变化。针对此例，图 3-3 中 2 个基因是已经报道的在 10T样品中高表达的基因。
9、 样本间表达差异基因的信号通路相关分析
对差异表达基因进行功能分析和信号通路分析。 结合样本性状差异， 鉴定与性状 关联的候选基因，以便通过进一步实验验证。
10、 根据 Tag距离 3’端的位置对 tag 和基因数目进行的统计分析
‘贰’ 检测基因表达水平差异的方法有哪些
基因的表达是dna-rna-蛋白,期间有转录水平调控、转录后调控、翻译后调控等多种调控机制影响该基因的表达.
所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表达多,可能是mrna多,也可能mrna变化不大,而是翻译多了；蛋白表达少,原因亦然.
从2个水平检测一个基因的表达,可以更全面地了解该基因在该组织某个时期或某种条件下的变化受到什么水平的调控.
所谓基因表达,就是从dna到mrna再到蛋白的一个过程,基因表达水平一般是通过该基因转录的mrna的多少来衡量的.
每个基因转录产生的mrna的量,是受到时空等多种因素调控的,个体在不同的生长发育阶段,或者不同的组织水平,基因转录出mrna的量都是不一样的.
例如,当某种植物长期生长在高盐的环境里,该植物体内与抗盐相关的基因的表达量就会增加,以适应这种高盐环境,是植物能够生存下来,这时植物抗盐相关的基因表达水平就相对高
检测基因表达的方法：
转录水平检测：rt-pcr，real-time pcr，northern blot
翻译水平检测：western blot
还有直接检测，如报告基因、融合荧光蛋白等。
rt-pcr是反转录pcr，是半定量方式。real-time pcr可以精确定量。 二者不同。后者为了区别于rt-pcr，一般不缩写。
各位观众老爷们大家好!我是吆五，打算从今以后不定期分享一些生物类的专业知识。
一方面供自己学习积累，另一方面也希望对大家有所帮助。
生物是很枯燥的呢
‘叁’ 外源基因表达的检测是什么
检测外源基因是否转化成功，首先对报告基因进行检测，然后再进行目的外源基因的检测。目的外源基因的表达可分转录和翻译两个水平，转录是以DNA为模板合成mRNA的过程，翻译则是指以mRNA为模板翻译成蛋白质。目的基因表达检测亦可在两个水平上进行，在转录水平上对mRNA进行检测，在翻译水平上对蛋白质进行检测。
1.报告基因的酶法检测
主要的报告基因，例如Gus基因、Cat基因、冠瘿碱合成酶基因、NptⅡ搭庆汪基因和荧光素酶基因皆可根据各自的功能，采用酶法检测。
2.外源基因转录水平上的检测。
Northern杂交（Northernblotting）以RNA为探针，检测外源基因转录产物特异mRNA。Northern杂交也有斑点杂交和印迹杂交。斑点杂交只需将RNA样品点样在固相膜上直接与探针杂交，但只能鉴定外源基因是否转录；而Northern印迹杂交则需将RNA样品进行电泳分离，然后转移到固相膜上，再与探针杂交，可对外源基因的转录状况进行较详细的分析。Dot-Northern杂交是将总RNA提取物经多孔过滤进样器直接转移到杂交膜上，其余步骤与Northern杂交相同。Northern杂交对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。
3.外源基因翻译水平上的检测
外源基因翻译水平上的检测通常用Western杂交（Westernblotting）。Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的知仔特异蛋白质检测方法。转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解在含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离开来，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性座位。然后差岩加入特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白与一抗结合后，再加入能与一抗特异性结合的二抗，二抗事先已经标记，根据二抗上标记化合物的性质检出。由检测结果，可知目的蛋白是否已在被检植物细胞中表达、其浓度以及大致的分子量。
‘肆’ 检验目的基因是否成功表达用什么方法
应用分子杂交进行检测。
分子杂交技术：不同的dna
片段之间，dna
片段与rna
片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。检测目的基因是否进行转录，即有无互补rna产生，可以使用分子杂交技术。
‘伍’ 检测dna上的目的基因是否表达常用的检测方法是
A 对目的基因的检测和表达检测的方法混淆，不能准确应用。目的基因的检测常采用DNA分子杂交技术，即将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若出现杂交带，则表明目的基因已插入到染色体中。DNA—RNA分子杂交与抗原——抗体杂交法是目的基因的表达检测。目的基因是否转录出了相应的信使RNA分子，用DNA—RNA分子杂交法检测。细胞内是否合成了由目的基因控制的蛋白质，使用抗原——抗体杂交法检测。要准确区分目的基因的检测和表达检测使用的方法。显微注射技术是目的基因导入受体细胞的方法。
‘陆’ 如何检测基因表达水平
1 western bloting
a.将编码目标蛋白基因通过载体进行体外重组，然后导入宿主细胞表达
b.将目标蛋白注入兔子或其他动物体内获得一抗
c.将样品蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移、吸附固定
d.用一抗与之杂交再用二抗检测其是否表达
2 fluorescent real-time PCR
a.提取样品总RNA，再通过超速离心获得mRNA
b.用逆转录酶获得cDNA
c.加入特异性探针
d.利用专门的仪器检测荧光强度即可
3半定量 PCR
a.提取样品总RNA，再通过超速离心获得mRNA
b.用逆转录酶获得cDNA
c.做半定量PCR
4cDNA microarray
5蛋白质 芯片
实质就是高通量的分子杂交，免疫酶连反应再运用计算机处理
‘柒’ 检测受体细胞中的目的基因是否表达的方法是什么
首先要确认目的基因已经传入受体细胞。然后再检测其表达情况，一般有两种方法：一个是通过特定性状来判断目的基因是否表达，比如导入的目的基因是编码某种酶的，那么最简便有效的方法就是经过表达后检测有没有相应酶的活力，同时跑蛋白胶，看有没有预期的目的条带，因为对于酶来说，有时候目的基因虽然表达了，但是酶没有活力，这时就不是表达的问题了。另外一个就是利用抗原-抗体特异性结合原理，检测目的基因是否翻译成蛋白。