表观病害的检测方法

A. 气传病害的病原物监测有哪些方法

由于大多数植物病原物的个体微小而数量极大，难以用眼睛观察和记数。真菌的“个体”单元也无从划定，虽然菌核和孢子可以计数而菌丝体的生物量和增长潜能却难以测量。在多数情况下，一定空间范围内病原物群体的绝对数量，包括生物量和个体数是无法测定或难以估计的，即便在理论上可以，而在实际上不能实现。所以，在植物病害流行学研究和病害预测中监测的是病原物的相对数量，空中孢子捕捉和土壤带菌量测凯握定都属于这种性质。另一方面，由于监测的目的是了解其动态，只要采用规范的方法，依据相对数量也能够达到要求。

1.病斑产孢量测定

病原物发育进度，如子囊壳成熟进度可作为小麦赤霉病、梨黑星病等病害中短期预测的依据。也可以测定病斑的产孢面积和单位面积上的产孢数量。产孢面积可用印有直角坐标网格的胶片或纱窗来测量，也可以用直尺测量长、宽，再乘以一定的系数来计算较大病斑的面积。产孢量测定方法通常采用套管法，即将产孢叶片插入开口朝上的大试管内，为防止试管内通风不良，凝结水气也可以改用两端开口的J形管。每次换管前要将叶片上的孢子抖落到管中，也可以用少量0.3%吐温液冲洗（包括管壁）。冲洗液直接或离心后，用血球记数器镜检孢子数目。也可以用分光光度计比浊法标定悬浮液的孢子量。苏海等（1990）曾采用透明胶带黏在叶片上，使孢子堆附近形成一个小的气室的方法，测定小麦叶锈病单孢子堆产孢量，也取得了良好的效果。

2.空中孢子量和叶面降落孢子量的监测

气传病害的传播体数量是病害预测预报的重要依据。除上述病斑产孢量测定以外，有许多人进行了空中孢子量和叶面着落孢子量的监测。空中孢子捕捉的方法很多，大体可以分为有动力和无动力两种蠢孙伍。最简单的莫过于玻片法。只要将凡士林涂在玻片上，平放在作物冠层内的不同高度，或在田间竖木杆，在其不同高度和不同方向锯成一些缺口，再将两片涂了凡士林的玻片卡在缺口处。带或定时更换玻片镜检每视野孢子数或整张玻片上的孢子数量。有动力的孢子捕捉器如旋转胶棒孢子捕捉器（rotor-rodsampler）、车载孢子捕捉器。它们可以定时开关，由于增加了经过胶棒的空气量，即使在无风的天气条件下也能达到较好的捕捉效果。

在一些特殊场合，也采用生物捕捉法，即在无菌条件下培养感病植株，定期移到需要监测的地点，暴露一定时间后再移到无菌条件下诱发病害。小麦条锈病研究中也曾在交通不便的山区，按不同海拔高度少量种植高感品种，定期观察它们的发病情况。当然这种监测已经不仅仅局限于病原物，也包含了对发病条件的监测。

3.生理小种的检测

生理小种是种、变种或专化型内由生物型或生物型群所组成的群体。病菌生理小种之间在形态上无差别，主要根据它们对不同品种的毒力差异来划分。在病害流行预测中重要的是了解病原物群体中不同小种的比例和变化。为此，需要大量采集病原菌标样，经过单孢分离（或单病斑、单孢子堆分离），然后在一套鉴别寄主上鉴定其小种。由此获得各小种出现频率（或比例）。我国自1964年以来长期开展了小麦条锈病菌生理小种的监测工作，这项监测是小麦条锈病流行预测的重要依据，对抗病育种工作也有指导意义。

B. 水产病害疾病的检测方法有哪些

粗糙的方法可以观察水产动物的外表、形态，有没有病变情况。精确的方法有细菌培养、显微镜观察、分子检测等。细菌培养时间长，通常水产病害爆发十分快，显微镜观察需要大量经验才能判断正确。所以商业上的办法一般是分子检测，可以快速的出结果，一般2-3个钟，并且是分子水平上的检测，十分精确。我之前在广东一间好像叫迪澳生物的公司购买过，好像有分子检测的。

C. 我国检疫的检验方法分为哪三种

以下方法：
1、现场检疫：输入、输出应检物抵达口岸时，检疫人员登机、登轮、登车或到货物停放场所实施检疫。
2、实验室检疫：检疫人员按有关规定或要求对输入、输出的检疫物作动物疫病、植物病害的实验室检测。
3、隔离检疫：动物在入境后或出境前，必须在出入境检验检疫机关指定的隔离场作隔离检疫(大、中动物45天，小动物30天);入境植物、种苗及其他繁殖材料需作隔离检疫的，应在指定的隔离圃隔离种植，经过至少一个生长周期的隔离检疫。

D. 内部病害检测的方法主要有

隧道内部病害主要包括：衬砌厚度不足、背后存在空洞、衬砌背后富含地下水或围岩出现弱化、混凝土强度不足以及不密实等，这些内部病害容易诱发开裂、渗漏水、剥落剥离等结构表观病害，甚至引起坍塌、突涌水等灾害事故，严重危及结构及交通安全。因此，开展隧道内部病害的检测，对掌握结构技术状态和保障运营安全至关重要。
传统的隧道病害的检测方法中，钻芯法可检测隧道内部病害，但势必对隧道结构造成二次损伤，可能诱发突发性的灾害，且检测效率极低，无法满足大范围养护检查的需求。为此，探地雷达、超声探测仪、回弹仪等无损检测仪器被尝试应用于隧道内部病害检测。
探地雷达和超声检测技术已被大范围的应用于隧道无损检测，红外探温技术也得到一定应用。其中，探地雷达可用于检测衬砌厚度、背后空洞，并可以判断衬砌背后有无大规模的地下水体；超声波则主要用于检测混凝土强度、衬砌与初期支护是否密贴。

E. 植物病害的诊断方法

植物病害的诊断方法
（一）非侵染性病害的诊断 通田间观察、考察环境、栽培管理来检查病部表面有无病征。
非侵染性病害具如下特点：
（1）病株在田间的分布具有规律性，一般比较均匀，往往是大面积成片面发生。没有先出现中心病株，没有从点到面扩展的过程。
（2）症状具有特异性：
1、除了高温热灼等能引起局部病变外，病株常表现全株性发病。如缺素症，水害等。
2、株间不互相传染。
3、病株只表现病状，无病征。病状类型有变色，枯死、落花落果、畸形和生长不良等。
（3）病害发生与环境条件、栽培管理措施密切相关。
（二）侵染性病害的诊断
例如真菌病害：
1.大多数真菌病害在病部产生病征，或稍加保湿培养即可生出子实体来。
2.但要区分这些子实体是真正病原真菌的子实体，还是次生或腐生真菌的子实体，因为在病斑部、尤其是老病斑或坏死部分常有腐生真菌和细菌污染，并充满表面。
3.较为可靠的方法是从新鲜病历的边缘作镜检或分离，选择合适的培养基是必要的，一些特殊性诊断技术也可以选用。
4.按柯赫氏法则进行鉴定，尤其是接种后看是否发生同样病害是最基本的，也是最可靠的一项。

F. 如何进行植物病害诊断和鉴定:

进行植物种植，传统的就是除草、浇水和防治病虫害，那么植物病虫害应该如何去防治呢？首先要知道如何辨别别植物病虫害，我们生产的植物病害检测仪可以迅速的将植物病虫害进行鉴别，不过这是建立在知道植物病虫害的发病机理上的，下面我们一起看下植物病虫害是如何被引发的。
一、非传染性病害：植物在不适宜的土壤上，或是遇到不适合的气候、水分、肥料过多过少等所引起的病害。如甜菜地里如果土壤中缺乏微量元素“硼”，就要引起甜菜根变黑腐烂，叫做缺硼病。这一类的病害不会传染蔓延，所以叫做非传染性病害。

二、传染性病害：是由病菌侵害发生的，能够传染，所以叫做传染性病害。这类病害种类最多。引起传染性病害的病菌大多数为真菌，其次就是病毒和细菌，以及线虫和寄生性种子植物等。
植物得病后，一般常见的症状有:变色、斑点、矮化、丛生、黄化、坏死、腐烂、萎蔫、缩叶、缩果、扭曲、瘤肿、畸形等。叶面上有时布满霉状物(黄色、红色、绿色等)、黑粉状物、白粉状物、锈状物以及小黑点等颗粒状物。
传染性病害中，由于病原菌不同，植物生病后，外部的形态改变也不一样，而且同一种寄生物在不同的植物上或者在同一植物的不同发育时期，以及受环境条件的影响，都可表现不同的症状。相反，不同的寄生物也可能引起相同的症状。因此，对植物病害除分析发病的原因外，还必须进一步鉴定病原生物，才能做出正确的诊断。对植物病害的诊断方法一般采用以下几个步骤：

1.症状诊断：
在诊断植物病害时，首先进行症状观察，根据症状特点，区别病害还是伤害。伤害是没有病变过程，病害是有病变过程的。如果是病害，还要区别是非传染性的，还是传染性的病害。在观察症状时，一般用扩大镜或用肉眼观察病株的外部表现，当外部症状不明显时，再进行病理解剖，检查内部症状。由于各种病害在田间的发生和发展其表现有一定的规律，因此在观察植物病害的症状时，应特别注意：
(1)病害的普遍性和严重性多；
(2)病害发展和在田间的分布；
(3)发生时期和植株生育期；
(4)受害寄主和部位位；
(5)栽培管理方法等。

病毒病害与非传染性病害容易混淆，因为病毒病害在外表看不出病症，区别病毒病与非传染性病害，除根据有无传染现象外，还可根据病害的发生特点。非传染性病害在田间大都是普遍、均匀、成片发生，发病地点与地形土质或环境条件有关。病毒病害在田间多是分散发生，在病株周围可找到健株，其症状除呈现花叶、黄化或矮缩畸形外，还常与传毒昆虫的活动有密切关系。

2.病原鉴定：
鉴定病原是对植物病害进行诊断最可靠的方法。对不同性质的炳原必须采取不同的鉴定方法。
(1)非传染性病害的病原鉴定
在对养分、水分、温湿度和厌围环境条件进行分析的基础上，可进行化学诊断，就是将有病的植物榨出液或病土进行分析，测定矿物营养(如氮、磷、钾、硫、铁以及其他微量元素的含量)，是否符合健康植物的标准，并查明所缺元素。其次还可以进行人工诱发试验，如水培法和砂培法，人为的提供可疑的类似条件，观察是否发病。
(2)传染性病害的病原鉴定
①病毒病害的病原鉴定

病毒病害的病原用普通显微镜观察不到组织病变。目前在电子显微镜还不普及的情况下，多采用人工接种试验来验证。人工接种试验是用病株汁液磨擦接种、嫁接、昆虫传染等方法。同时还可以根据病毒的生物学特性，如传播方法、寄主范围、寄主反应、体外保毒期、稀释终点以及血清方法等来区别病毒的种类。有些植物病毒还可以采用指示物进行鉴定。
②细菌病害的病原鉴定

对细菌病害的病原鉴定，多采用“细菌溢”的方法。具体是切取小块病组织制片，放载玻片于显微镜下检查，如觉现有“细菌溢”从病组织(维管束)涌出，即可勿步确定为细菌病害。
如果鉴定细菌的种类，就可进行革兰氏染色，通过阳性和阴性反立来区别。此外还可以进行分离培养，获得较纯的培养菌种，然后通过伤口或白然孔(水孔、皮孔、气孔等)人工接种，来确定细菌的种类。

目前，对细菌病害病原的鉴定，较迅速准确的方法是采用血清反应。具体方法是取一定病原的细菌液少许放载玻片上，然后加入某种用生理盐水稀释过的“抗血清”，如果两者产生“凝集”即证明是某细菌病害的病原。例如鉴定马铃薯环腐病的病原菌时，可将已培养好的环腐病细菌液注射到兔子体内，然后抽取兔子血液，使沉淀后取上部的血清(即抗血清)，用生理盐水稀释后放载玻片上，与被怀疑为马铃薯环腐病的病原细菌掖混合，如产生“凝集”，即证明为环腐病病原。否则为非环腐病病原。
③真菌病害的病原鉴定

鉴定真菌病害，一般常用的方法是挑取病株组织上的菌丝或子实体制片，然后置显微镜下观察病菌的形态、特征、色泽、大小、结构等。其次是采用分离培养和接种试验。分离培养是切取小块病株组织经表面消毒和灭菌水洗后，移到一定的培养基平板上，在一定的恒温下培养，几天后观察菌落、菌丝体、无性抱子、有性抱子等形态、色泽。接种试验应根据真菌病害不同的侵染类型，将病菌抱子进行拌种、花器接种、土壤接种、涂抹接种或将抱子棍悬液进行喷雾接种。
④线虫病害的病原鉴定

植物受线虫为害后，多在受害部位产生虫廖或膨胀的形态变化，剖切虫瘦或膨胀部分用针挑取内部含有物制片，然后放显微镜下观察有否线虫及形态特征。有些线虫病并不引起植物形态变化，可采用漏斗分离法和叶片染色法进行检查，作出诊断结果。

G. 怎么进行植物病害的诊断

病害诊断的程序一般包括：（1）仔细观察发病植物的所有症状，包括植物病状如变色、坏死、腐烂、萎蔫和畸形，以及病原物的病症如霉状物、粉状物、锈状物、颗粒体等，寻找对诊断有关键性作用的症状特点，是否大面积同时发生等，进行症状的识别与描述。（2）仔细分析，包括询问和查对资料在内，要掌握尽量多的病害特点，调查询问病史与有关档案。（3）采样检查结合必要的镜检、剖检等全面检查，专项检测。（4）逐步排除法得到适当结论，判断出植物病害的类别：是侵染性病害还是非侵染性病害，如是侵染性病害的是由哪些病原物引起的，如是非侵染性病害的是由外界伤害还是由营养元素缺乏引起的，是缺什么营养元素引起的等。

H. 花卉病毒类似病害的诊断和鉴定方法有哪些

植原体、螺原体等无壁菌门的原核生物造成的植物病害与植物病毒产生的症状相似，无病症表现，因此，它们又叫病毒类似病害。花卉上比较常见的是植原体病害，因此我们介绍一下植原体病害的诊断和鉴定。

1 超薄切片，电镜下观察植原体

方法如植物病毒的超薄切片和电镜观察。

2 抗生素治疗诊断

用四环素、土霉素和金霉素等对受病植株进行叶面喷施和灌根，植原体对这几种抗生素敏感，病害症状可以得到缓解。而植物病毒对抗生素不敏感，如果施用，对病害无效。

3 植原体PCR检测

根据植原体的共同保守序列，用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到植原体的特异扩增带。

还可以将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到与引物设计相符的植原体的特异扩增带，说明为植原体病害。

这里以仙人掌植原体丛枝病的PCR检测为例，介绍植原体的PCR检测技术。

实验操作如下：

Ⅰ.总核酸提取

（1）取0.3g植株幼嫩组织，用液氮冷冻后充分研磨成粉状。

（2）移入含有0.6ml预热到60℃的CTAB DNA提取缓冲液中，在60℃水浴中温浴30min。

（3）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），抽提30min。

（4）12000r/min离心8min，取上清液，重复（3）、（4）步直至蛋白质除尽。

（5）加入氯仿∶异戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min离心8min，取上清液。

（6）加入等体积预冷的异丙醇及1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.2），混匀，-20℃保持至少30min，14000r/min离心10min，使核酸沉淀。

（7）用70%乙醇洗涤2次后，.真空干燥。

（8）沉淀溶解于100μl TE缓冲液中。

（9）取10μl DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，计算DNA浓度。其余于-20℃冰箱中保存备用。

Ⅱ.PCR扩增

参照Lee所报道的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′

R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′

R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′

引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μmol/L。

直接PCR（Direct-PCR）：

（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列试剂

10×PCR反应缓冲液 5μl

5mmol/L MgCl2 4μl

2.5mmol/L dNTP 4μl

R16mF2（或R16F2） 3μl

R16mRl（或R16R2） 3μl

4U/μl 1TaqDNA聚合酶 1μl

模板 2μl

加入双蒸水至终体积为50μl，混匀并加入30μl石蜡油。

（2）PCR扩增。反应循环为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存。

（3）取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

巢式PCR（Nested-PCR）：

将用引物对R16mF2/R16mRl扩增的直接PCR产物按1∶40比例稀释后，作为反应模板，引物对换为R16F2/R16R2，退火温度升高至60℃，其余反应条件同直接PCR。

Ⅲ.结果

用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到一条约1.5kb的特异扩增带（图1）。通过实验，用泡桐丛枝作为植原体的阳性对照，检测出YNOl样品（仙人掌品种珊瑚枝丛枝）和YNO2（仙人掌品种堆罗汉丛枝）为植原体病害。其他YNO3（仙人掌品种猪耳掌丛枝）、YNO4（仙人掌品种金狮子丛枝病）、YNO5（仙人掌品种青海波丛枝）不是植原体病害，可能为品种的特性。

图1 直接PCR扩增结果

I. 植物细菌病害的诊断方法有哪些

1直接观察 观昌喊察拆棚病原的病害病症
2镜检 分离培养并在旅迅则显微镜下观察特征
3利用指示植物
4血清学方法

J. 如何对植物病害进行标本采集和鉴定

园艺纳旅植物病害标本采集与制作
一、目的要求
学习采集、制作和初步鉴定植物病害标本的方法,了解当地园艺植物常见病害种类、症状特征和发生情况,为识别园艺植物病害，安全保存植物病害标本奠
定基础。
二、材料和用具
标本夹、标本纸、采集箱、锯子、剪刀、小刀、镊子、放大镜、塑料袋、铅笔、记录本、标签、体视显微镜、显微镜、载玻片、盖玻片、挑针、标本瓶、大烧杯、酒精灯、滴瓶及常用植物病害标本保存液等。
三、内容和方法
1.采集用具
（1）标本夹 主要用于夹压各种含水分不多的病害叶片标本，多为木制或铁制的栅状板。
（2）标本纸 应选用吸水力强的纸张，可较快吸除枝叶标本内的水分，要保持纸张干燥和清洁。
（3）采集箱 采集较大或易损坏的组织如果实、根、茎、块根、块茎以及在田间来不及压制的叶片标本。
（4）枝剪、小刀、放大镜、麻纸袋、塑料袋、记载本、标签等物品。
2.采集方法
（1）采集具有典型症状的病害标本，尽可能采集到不同时期、不同发病部位的标本。
（2）采集有病征的病害标本，以便进行病原物鉴定工作。真菌病害的病原一般有无性、有性两个阶段，应尽量在不同的时期分别采集。有些真菌的有性子实体常在地面的病残体上产生，也要注意采集。
（3）避免病原物混杂，采集时对病原物容易混杂、污染的标本，如锈病、黑粉病、白粉病等要分别用纸夹（包）好，以免观察病原物时发生差错。
（4）随采集随压制，或用湿布包好，防止变形、干燥卷缩，给标本制作造成困难。
（5）随采集随记载，记录的内容一般包括标本编号、寄主名称、病害名称、病害危害情况、采集地点、采集环境、采集日期、采集人等项目。标本应帆亮挂有标签，标签上的编号与同一份标本在记录本上的编号必须相符，以便查对。
（6）每种标本采集的数量不能太少，一般叶斑病类标本应在10张以上。
3．蜡叶标本的制作
对于含水量少的标本，应随采集随压制，以保持标本的原形；含水量多的标本，应自然散失一些水分后，再进行压制；有些标本制作时可适当加工，如标本的茎过粗或叶子过多，应先剪掉一部分再压制，防止标本因受压不匀，或叶片重叠而变形。有些全株性的标本，可将标本折成适当形状后再压制。压制标本也应附有标签。为避免压制的标本变形，并使植物组织中的水分易被标本纸吸收，标本夹好后，要用绳子将标本夹捆紧，放到干燥通风处。要注意勤换标本纸，使标本尽快干燥，以保持原有色泽，并可避免发霉变质。一般前4d每天早晚各换1次，以后每天更换1次，直至干燥为止。干态茄宽燥后的标本移动时应十分小心，以防破碎。对于茎秆、枝条等粗大标本，可放在通风处自然干燥，但注意不要使其受挤压而变形。
标本经压制干燥后，需进行选择整理，并填写好标签一并放入蜡叶标本袋或蜡叶标本盒中保存，在标本袋或标本盒上也要贴上标签，然后按寄主或病原分类存放。存放时要避光照、潮湿、灰尘，防止虫蛀。
4．浸渍标本的制作
柔软多汁的果实、块茎、块根及肉质的菌类子实体，不适于干制，必须用浸渍液保存，以便保持标本的色泽和症状特征。浸渍液的配方很多，常根据浸制标本的色泽和浸制的目的进行选择。
(1)防腐浸渍液 ①5%福尔马林50ml,95%酒精300ml,水2000ml；②70%酒精；③5%福尔马林。此液用于防腐，而不要求保持原色。用于保存肉质果实、鳞茎、块根,也可用于保存肉质的高等菌类子实体。浸渍时应将标本洗净，使浸渍液淹没标本，若标本上浮，可用线将标本固定在玻片或玻棒上。若浸泡标本量大，浸泡数日后再换一次浸渍液。
(2)保持绿色浸渍液 ①醋酸铜液 将结晶的醋酸铜逐量加到50%的醋酸中，直到不溶解为止，配成饱和溶液,然后将饱和液稀释3～4倍后使用。先将稀释液加热至沸，投入标本。当标本原来的绿色被漂去，经3～4min,待绿色恢复后，即将标本取出，用清水洗净，然后保存于5%福尔马林液中，或压成干标本。此种方法保色能力较好，但标本必须煮过。棉铃、葡萄和番茄的果实等不能煮的标本就不能采用。②硫酸铜-亚硫酸浸渍液 将标本浸在5%的硫酸铜溶液中6～24h，取出用清水漂洗数小时，然后保存在亚硫酸溶液中。亚硫酸溶液的配制，可用含5%～6%二氧化硫的亚硫酸溶液15ml，加水1000ml，或以浓硫酸20ml，加在1000ml水中，然后加入亚硫酸钠16g即配成。这种方法适用于不能煮沸的棉铃、水果等。
(3)保存黄色和橘红色标本浸渍液 含叶黄素和胡萝卜素的果实如杏、梨、柿、黄苹果、橘桔或红辣椒等,用亚硫酸溶液保存为适宜。注意浓度不宜过高，因亚硫酸有漂白作用。浓度过低防腐力不够，影响保存,可加少量酒精。果实浸渍后如发现崩裂，可加少量甘油。
(4)保存红色浸渍液 红色标本中主要含有花青素,用瓦查(Vachs)的红色浸渍液较好。其配方为硝酸亚钴15g,氯化锡10g,福尔马林25ml,水2000ml。将洗净的标本完全浸没在上述溶液中，浸渍两星期后，取出保存在福尔马林10ml,亚硫酸饱和溶液30～50ml,95%酒精10ml,水1000ml的浸渍液中。标本瓶应加盖密封,并贴上标签。
园艺植物病害的病原物还可制成玻片标本永久保存，作为鉴定病害种类之用。
四、实训作业
1．每人采集、制作园艺植物病害蜡叶标本10～15件,制作浸渍标本1～2件。
2．每人写1份园艺植物病害标本采集制作的实训总结报告。