常见的蛋白质检测方法有哪些

① 蛋白质的检测方法有哪些

1、凯氏定氮法

凯氏弊余乎定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

3、酚试剂法

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。

缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中租悉有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 

缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

5、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。

在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。

缺点：由于各毁谨种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

② 常用的血清蛋白质含量测定方法有哪些

四种血清总蛋白质的测定的方法：

1.基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚试剂比色法 由于各种蛋白质分子中上述两种氨基酸的组成比例不同，特别是白蛋白含色氨酸为0.2%，而γ-球蛋白中含量达2%-3%，导致较大的差异。Lowry的改良法在酚试剂中加入Cu2+，集中原法和双缩脲反应两者的作用，使呈色灵敏度提高。其中75%的呈色依赖于Cu2+.反应产物最佳吸收峰在650-750nm，方法灵敏度为双缩脲方法的100倍左右。有利于检测较微量的蛋白质。但试剂反应仍易受多种化合物的干扰。

2.紫外测定法 采用280nm和215/225紫外吸收值，计算蛋白质含量280nm 是由于蛋白质分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特异性和准确性受蛋白分子中该种氨基酸的含量比例影响甚大。尿酸和肝红素在280nm附近有干扰。紫外区200-225nm是肽健的强吸收峰。在此区域其吸收值为280nm的10-30倍，将血清稀释1000-2000倍可以消除干扰物质的影响。

3.采用沉淀反应进行散射比浊法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚为简便，不需特殊仪器，技术关键在于：①选择最佳试剂浓度及温度；②混匀技术；③选用的标准；④待测标本中的蛋白浓度。

4.染料结合法 蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑（amino black）与考马亮蓝（comassive brilliant blue ）。这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。

③ 请问蛋白质的检验方法有多少种（请尽量详细,

蛋白质测定方法:
测定蛋白质的方法可分为两大类：
一类是利用蛋白质的共性,即含氮量 、肽键和折射率测定蛋白质含量 ；
另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团 以及芳香基团等测定蛋白质含量.
(1) 凯氏定氮法:是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物,故此法的结果称为粗蛋白质含量.(是食品上蛋白质含量测定最常用的方法)
(2) 双缩脲法
(3) 染料结合法
(4) 酚试剂法：方法简便快速,故多用于生产单位质量控制分析.
(5) 紫外分光光度法-近红外光谱法

④ 测定蛋白质含量的方法有哪些

1、凯氏定氮法

凯氏定氮法是由丹麦化学家凯道尔于1833年建立的，现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，是分析有机化合物含氮量的常用方法。

凯氏定氮法的理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~一19%)，因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即: 蛋白质含量=含氮量/16%。

2、紫外吸收光谱法

紫外吸收光谱法又称紫外分光光度法，是根据物质对不同波长的紫外线吸收程度不同而对物质组成进行分析的方法。此法所用仪器为紫外吸收分光光度计或紫外-可见吸收分光光度计。

光源发出的紫外光经光栅或棱镜分光后，分别通过样品溶液及参比溶液，再投射到光电倍增管上，经光电转换并放大后，由绘制的紫外吸收光谱可对物质进行定性分析。

(4)常见的蛋白质检测方法有哪些扩展阅读

蛋白质含量测定的意义：

膳食蛋白质符合人的需要时，可维持正常代谢，生成抗体，抵抗感染，有病也易恢复。相反，蛋白质供给不足时，会减轻体重，易患贫血，容易感染疾病；创伤、骨折不易愈合；严重缺乏时，血浆蛋白降低，可引起浮肿。

此外癌症与蛋白质摄入量不足也有一定关系。但是，蛋白质摄入过多也可造成肾脏负担。食物蛋白质在体内代谢所生成的尿酸、氨、酮体等累积过多，可导致衰老；而氨还对机体有毒性，不仅会陡然增加肝脏负担，还会增加胃肠负荷，引起肝肾受累以及消化不良等症。所以，蛋白质的摄入量要适当。

⑤ 测量蛋白质总量的方法有哪些

1.凝胶过滤法 凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷的多少。SDS（十二烷基磺酸钠）是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。
3.沉降法（超速离心法） 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算出蛋白质的分子质量。质的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算出蛋白质的分子质量。

⑥ 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。