移液枪检测弧菌方法

‘壹’ 副溶血弧菌的检测方法

用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。
此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。 副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），K抗原（荚膜抗原）及H抗原（鞭毛抗原），其中血清学分类上有意义的是前两谨侍祥者：O抗原有13种血清群，K抗原有65种血清型。
进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3%食盐水作成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集试验，同时用无菌生理盐水作对照，如O凝集反应阳性时，可用祥搏不经加热的菌悬液进行K抗血清玻片凝集反应分型判定。天津生物芯片公司的诊断血清产品覆盖了该菌所有的O血清群及K血清型。 所有副溶血弧菌分离株都含有不耐热溶血毒素（TLH），这种溶血素是副溶血弧菌所特有的，因此它的编码基因tlh基因常被用作检测副溶血弧菌的靶基因。而tlh并不是一个毒素基因，真正与致病相关的是副溶血弧菌的耐热直接溶血素（TDH）和溶血相关溶血素（TRH），因此它们的编码基因tdh、tlh基因常被用作副溶血弧菌致病性检测的特异基因。基于此，天津生物芯片推出一系列常规PCR试剂盒及荧光PCR试剂盒。
1）常规PCR：鉴定标准是通过电泳谈肢来判断是否有扩增的核酸片段以及扩增产物的大小是否正确。
2）实时荧光PCR：通过对实时荧光PCR反应的每一个循环产物进行荧光信号的实时监测来判断分析。

‘贰’ 革兰氏染色法

革兰氏染色法的原理
革兰氏染色法的原理： 简单来说：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。

具体来说：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色； 而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色数衡答剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽薯慧聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。

(2)移液枪检测弧菌方法扩展阅读：革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，属于复染法。这种染色法是由丹麦医生拦肆革兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。

革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难区别。

经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。 操作流程：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： （1）载玻片固定。

在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。 （2）草酸铵结晶紫染1分钟。

（3）自来水冲洗，去掉浮色。 （4） 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

（5）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。

（6）用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

参考链接：网络-革兰氏染色法。
革兰氏染色法的原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

(1)载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

(2)草酸铵结晶紫染1分钟。

(3)自来水冲洗，去掉浮色。

(4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

(5)用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。

(6)用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。
革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。

为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。

有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。 [原理]：革兰氏染色目前有三种观点：等电点学说、化学学说和渗透学说。

1. 等电点学说，革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4-5）低，加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，致使两类菌的等电点差异扩大，因此阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。 2.化学学说，碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被丙酮酒精脱掉，呈革兰氏染色阳性。

因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被丙酮酒精脱色而呈革兰氏染色阴性。 3.渗透学说，乙醇使阳性菌所含粘肽多糖脱水而致细胞壁间隙缩小，通透性降低，在菌体内保留了染料-碘复合物，呈紫色。

阴性菌含粘肽少，细胞壁变化不大，通透性不受影响，菌体内的染料-碘复合物较易透出，失去紫色，被复染成为红色。 [试剂]：Crystal violet（结晶紫）、Gram Iodine（碘液）、Decolourizer（丙酮酒精）、Safranin（稀释沙黄） [操作]： 1.标本处理：（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。

（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml），经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。 2.涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。

制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。

3. 染色方法： （1）.加上Crystal violet（结晶紫）后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。 （2）.加上Gram Iodine（碘液）后染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。

（3）.以Decolourizer（丙酮酒精）脱色约5-10秒，并用自来水冲洗之。 （4）.加上Safranin（稀释沙黄）后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。

（5）.吸干或在空气中凉干后，置油镜镜检。 4.结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。

[报告方式]：革兰氏染色：检出革兰氏阳性球菌 ；革兰氏阴性球菌 检出革兰氏阳性杆菌 ；革兰氏阴性杆菌 [注意事项]： 1.标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。 2.玻片通过火焰温度不能太高。

3.若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。 [临床意义]：通过革兰氏染色，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，便于临床治疗。

[附] 1 沙黄（番红）Safranine T [C20H19ClN4=350.85] 红棕色粉末；碱基性染料。在水中溶解，在乙醇中易溶。

2 碘液配制：0.01mol/l碘液——称取1.3g碘，置于50mol烧杯中，加入2.5g碘化钾及25毫升蒸馏水，不断搅拌之，使其溶解均匀。再加0.2mol浓盐酸（体积质量1.19g/cm3），再加蒸馏水稀释到1000mol。

溶液应贮藏在棕色试剂瓶中，储于低温暗橱内。有效期为一个月左右 革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代表。

大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存于肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特征为有一层out member 与阳性菌种不同。

目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主。
【革兰氏染色法he染色法姬姆萨染色法银染色法的机理可以举一些的
初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染.经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌.革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的.实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色.碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力.当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的.革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色.革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色.。
什么是革兰氏染色法？染色过程应注意什么
一、定义 革兰氏染色法是由1884年由丹麦医师Gram创立的一种复染色法，用以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，对其进行分类鉴定。

二、染色原理 1、G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

2、Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。三、染色目的 在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

四、染色方法步骤 1 、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2、 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4、 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

5 、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6 、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

7 、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 8 、脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

9 、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 10 、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

11 、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。五、注意事项 1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。

如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3、选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h,E.coli培养24h。

若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
什么是革兰染色法？其原理、结果和意义
革兰染色法由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。

原理：

G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

(1)载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

(2)草酸铵结晶紫染1分钟。

(3)自来水冲洗，去掉浮色。

(4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

(5)用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。

(6)用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

‘叁’ 水产养殖中对于池塘底质中弧菌的检测方法

水禅羡饥产养殖中对于池塘底质中弧菌的检测方法：抓一把池底的沙子混合少量池水，摇匀后，测瓶里水中弧菌。

预防池底弧菌对早期虾苗的影响方法：

1. 放养优质健康的虾苗是关键，减少苗带菌的情况。

2. 放苗后3天检测一次弧菌，在天气变化时，尤其重视做到2天一测，做到早发现早预防。因为弧菌的繁殖速度超快，一个弧菌分裂繁殖一代（2个弧菌）也只需要10分钟。一个池塘水体中肯定不止一个弧菌，有时我们感觉可能会超标时，建议在检测的同时，就先预防加以控制，因为很可能在我们检测结果还未出来的那10几个小时里，弧菌不断繁殖，虾就开始发病了。

3. 控制弧菌，尽量采用菌相+藻相+蛭弧菌的生物控制方案，不到非用不可，尽量减少消毒剂的使用。

4. 管理好水质和底质也是弧菌防控的关键。

5. 养殖动物和养殖水体是一个有机整体，我们在处理好水质的同时一定不要忽略养殖动物本身，本身体质好，抵抗力就强，携带的病原菌相对较少，反之则多，在养殖过程中会随代谢物排入水体污染水质，增加弧菌爆发的几率。因此在处理水环境的同时派磨加强贺返内服是关键。

6. 加大增氧，提高水体溶解氧含量，对抑制弧菌有明显效果。

7. 在放苗前，降低水体盐度可减少弧菌感染的机会。

‘肆’ 检测霍乱弧菌都会用到实验室仪器 列个清单哦

设备和材料
3.1 冰箱： -20℃～4℃。
3.2 恒温培养箱： 36±1℃。
3.3 暗视野显微镜： 10×～100×。
3.4 架盘药物天平： 0g～500g, 精确至0.5g。
3.5 锥形瓶： 100 mL、500 mL。
3.6 灭菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.7 灭菌平皿： 直径90 mm。
3.8 灭菌试管： 16 mm×160 mm.。
3.9 洁净的载玻片。
3.10 洁净的盖玻片。
3.11 接种环。
3.12 生物安全柜：Ⅱ级。
4.培养基和试剂
4.1碱性蛋白胨水。（pH8.4-8.6，8-10 mL）
4.2庆大霉裤州素琼脂。（培养基加热煮沸3次；一份源纯陆标本用一块90mm平皿）
4.3霍乱弧菌诊断血清：O1群和O139群霍乱弧菌诊断血清（标明名称、日期；稀释后的诊雹顷断血清放4-8℃保存，当年使用；未稀释的诊断血清冷冻保存，有效期内使用

‘伍’ 弧菌稀释液是什么

弧菌稀释液是一种用于处理食品和水样品的培养基。弧菌是海洋中常见的细菌，是一种厌氧细菌，能够仿念引起人类和动物肠胃道感染。因此，弧菌稀释液通常用于检测食品、食品加工厂以及其他热带和亚热带地区水源中是否存在弧菌。

弧菌稀释液的制备方法包括将稀袜孝释液加入含有营养物质的培养基中，并进行适当的混合和发酵处理，从而获得含有一定浓度的弧菌的培养基。常见的弧菌稀释液中会添加一定量的盐和营养物质，以提供弧菌生长的必要条件。

通常，在进行食品或水样检测时，需要将待检测样品加入到弧菌稀释液中，然后通过置于恰当的环境下进行培养，观察是否有弧菌的生长出现。这种方法可以在短时间备好困内对弧菌进行快速检测，以便进行必要的措施，防止疾病的传播。

‘陆’ 甘油保存菌种的方法，保存菌种的温度

回答
1、方法:准备好镊子、EP管、枪头等工具，并进行杀菌处理;手和镊子用酒精擦拭消毒，用镊子取出约10支的EP管放到试剂盒里;找到移液枪，取出50%的甘油(等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸)放到EP管里面，再取出菌种放到EP管里面;最后把所有的菌种都装入到一个大袋子里盖好盖子标注好保存起来，放入-20°C的冰箱里保存。2、温度要求:长期保存，建议在-70°C下冻存;短期保存，可在-20°C保存。
一、甘油保存菌种的方法
1、原料/工具
甘油、镊子、EP管、移液枪。
2、方法/步骤
(1)准备工具并杀菌:准备好镊子、EP管、枪头等工具，把这些工具放到高压轿配纤灭菌的锅里进行杀菌。
(2)把EP管放入试剂盒:用酒精将手和镊子擦拭消毒，用镊子取出约10支的EP管放到试剂盒里。
(3)把甘油和菌种放入EP管:找到移液枪，取出50%的甘油(甘油稀释至50%浓度的方法:等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸)放到EP管里面，再取出菌种放到EP管里面。
(4)保存并放入冰箱:把所有的菌种都装入到一个大袋子里盖好卖巧盖子标注好保存起来，放在-20°C的冰箱里保藏。
二、甘油保存菌种的温度
1、甘油保存菌种，闭仿若是长期保存，建议在-70°C下冻存，保藏时间一般为2-4年左右;在-20°C保存时间较短，通常只有1年左右。目前实验室大都采用-80°C(-70°C)冰箱保藏。
2、甘油冷冻保藏菌种是目前实验室应用最为广泛的一种的菌种保藏方法，原理是以甘油为保护剂，低温冷冻条件下，使微生物的新陈代谢趋于停止，从而达到长期有效的保藏。一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。这种方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。

‘柒’ 养殖生产过程中如何检测水体中的弧菌含量

将采集的水样进行弧菌培誉蚂养计数。采用平板庆培埋计数，将水样加吐温80℃后摇床震荡30分钟，10倍系列中差稀释，涂布弧菌选择性TCBS培养基，在28℃恒温条件下，培养48小时后计数。

‘捌’ 霍乱弧菌的检测方法

根据弧菌O抗原不同，分成Ⅵ个血清群，第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型：含AC者为原型（又称稻叶型），含AB者为异型（又称小川型），A、B、C均有者称中间型（彦岛型）。
1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株，推荐使用天津生物芯片生产的霍乱弧菌诊断血清。 1,普通聚合酶链反应法
核酸扩增技术，即聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。一般选择霍乱肠毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作为靶基因。一些非产毒株(如环境来源的菌株)有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表达调控基因(toxR)等也被选用为PcR的靶基因，这大大提高了检测的特异度.
2 ,多重PCR法
与常规PCR相比，多重PCR一次反应可检测多个基因，节省了时间和成本。国内、外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、tcp与其他基因如ompW、rfb、hly进行组合，作为共同的靶基因，克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重PcR同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株，可谓一举多得，大大提高了检测效率。
3.荧光定量PCR法
荧光定量PCR自动化程度高、特异性强、无交叉污染，在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来，随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光PCR仪的开发与广泛使用，多重荧光定量PCR技术日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为应用的热点. 与PCR方法相比，基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息，从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析，对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。但基因芯片成本较高，距离推广应用尚需时间等待 。

‘玖’ 微生物菌落检测中，这样的菌是什么细菌

细菌菌落总数是微生态制剂样品检测必做的一项指标。菌落总数检测同其他检验一样，也存在检测误差。平板计数法是检测饲料中细菌总数、活酵母数、芽孢杆菌数及空陵乳酸菌数的常用方法之一，因此，该值准确与否直接关系到微生物饲料添加剂类产品的质量好坏。微生物平板计数的通常方法为每个样品用 3个稀释度，每个稀释度常做 3个重复。但如何对平板菌落进行正确计数、3个稀释度以哪一个稀释度进行计数及微生物检测允许误差等问题，在饲料标准中并未有所规定，而这些问题与统计值的准确性密切相关。我们就实际检测芽孢杆菌工作中遇到一些菌落计数的问题，与大家进行探讨。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1样品：随机抽取微生态饲料添加剂合生素样品3份。
1.1.2培养基：营养琼脂。
1.1.3仪器设备：磁力搅拌器，无菌培养皿，培养箱，振荡器。
1.2 试验方法
1.2.1样品的振荡时间对菌数检测的影响
选择1个样品，称取10 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为l0、20、30、40和60 min。
用1 mL移液枪从中吸取1 mL样品悬浊液加入到盛有9 mL去离子水的试管中，用振荡器使样品充分均匀，以此类推，制成10-1～1O-7不同稀释度的样品溶液。
平板涂布法检测菌含量：用移液枪从样品稀释液中各吸取200uL，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35-37℃培养箱中培养24 h。
1.2.2检测方法斗租戚对菌数检测的影响
各个样品称取l0 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为40 min。并稀释成10-1～l0-7不同稀释度的样品溶液。
倾注平板法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取1 mL，每个样品稀释液3个重复，待培养基表面干燥后，将平板倒置于35-37℃培养箱中培养24 h。
平板涂布法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取200uL涂布平板，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35～37℃培养箱中培养24 h。
2结果
2.1样品的振荡时间对菌数检测结果的影响
采用细菌平板计数的方法，不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表1。从表l中可见：不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别。总体而言，在一定时间内，随着振荡时间的延长检出有效菌含量增加，说明细菌从载体上解析需要一定的时间；当振荡时间为40 min后产品中的菌含量基本稳定。采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含量。
表1 震荡时间对有效菌含量结果的影响 亿CFU／g
震荡时间
10min
20min
30min
40min
60min
含菌量
2
6
10.5
15
14
2.2 检测方法对菌数检测结果的影响
表2 检测方法对有效菌含量结果的影响 亿CFU／g
检测方法
样品平行
1
2
3
倾注平板法检测有效菌含量
16.1
13.0
15.3
平板涂布法检测有效菌含量
14.5
11.2
14.2
采用不同的检测方法，对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表2。从表2可见：不同方法获得的细菌菌落数量有差别，倾注平板法相较平板涂布法检测的菌含量多，但基本在20％误差范围内。平板计数法操作相对简单、快捷且影响因素较少。倾注法培养基营养分布较均匀，对部分蔓延菌落能控制，但对操作人员熟练程度要求相对较高。
3分析与讨论
3.1样品处理对结果的影响
取样时对样品取样口和取样工具要消毒，防止样品交叉污染。
3.2样品的均质处理对结果的影响
固体样品要用均质器或玻璃珠等充分均质，也可在稀释液中添加相应溶解液（如吐温80和液体石蜡等）的稀释液，以保证样品的充分均质。
测定芽孢杆菌活菌数时，不同振荡时型好间获得的细菌菌落数量有较大差别，因为细菌从载体上解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间，待测样品应在振荡器上充分振荡，使得芽孢杆菌可以充分和均匀地分散到待测溶液中，避免因为菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象。
3.3 试验过程中操作方法的影响
加样l mL时，用1 mL的吸管并且每做一个稀释度都要换1支吸管，否则稀释度间菌落计数误差会超过10％，说明存在操作误差。用吸管向平皿里加样，平皿开口要小，吸管要直立且加样结束后，让吸头接触皿底干燥处，保证加样的体积不少。