㈠ 2021-09-28PCR替代技术，RPA引物与探针的常见问题
RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。在这个基础体系中添入不同的酶和探针，可以实现多样化的RPA应用，比如RNA扩增检测和实时RPA检测等等。
生物通报道：重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。在这个基础体系中添入不同的酶和探针，可以实现多样化的RPA应用，比如RNA扩增检测和实时RPA检测等等。
RPA****反应需要用多少引物？
RPA基础反应每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有时，稍微改动一下引物的用量可以提高其性能。对不同引物浓度进行测试（从200nM 到600nM）将有助于找到最合适的引物浓度。
RPA****反应需要用多少探针？
RPA反应一般每次需要120nM探针。不过，略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内（从50nM到150nM），根据自己的具体应用对探针进行优化。
现成的PCR****引物能用于RPA****么？
多半不行。绝此御激大多数PCR引物不能用于RPA，因为它们太短了重组效率低。
现成的PCR****探针能用于RPA****么？
不能。绝大多数常用的PCR探针并不适合RPA反应。特别是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这样的酶活性与RPA根本不兼容。
怎样才算是好引物？我应该怎样设计RPA****引物？
RPA引物还没有一个严格的设计标准，所以需要进行筛森袜选。（引物设计具体参见： PCR替代技术，RPA全攻略之引物设计 ）
RPA****引物需要多长？
RPA引物一般在32至35个核苷酸之间。某些情况可能用到少于30个核苷酸的引物，但扩增过程会显着减缓。
RPA****引物应当相距多远？
这取决于你的具体应用。标准TwistAmp®试剂盒适用于不超过500bp的扩增产物。RPA扩增产物的大小是没有下限的，不过RPA引物一般需要扩增子超过80bp。扩增产物在100-200bp之间，可以实现最快的RPA扩增。
在特定条件下，RPA扩增产物能够达到2kb。不过，目前的TwistAmp®试剂盒无法生成这么大的片段。
我需要筛选多少引物？
这取决于你对检测灵敏度的要求。举例来说，如果目标分子上千，那么绝大多数引物都够用了。对灵敏度要求很高的话，最好是进行系统性的引物筛选。一开始筛选的时拆哪候，候选引物可以有10到20对。测试的引物越多，找到好引物的几率也就越大。
RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。在这个基础体系中添入不同的酶和探针，可以实现多样化的RPA应用，比如RNA扩增检测和实时RPA检测等等。
生物通报道：重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。在这个基础体系中添入不同的酶和探针，可以实现多样化的RPA应用，比如RNA扩增检测和实时RPA检测等等。
RPA****反应需要用多少引物？
RPA基础反应每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有时，稍微改动一下引物的用量可以提高其性能。对不同引物浓度进行测试（从200nM 到600nM）将有助于找到最合适的引物浓度。
RPA****反应需要用多少探针？
RPA反应一般每次需要120nM探针。不过，略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内（从50nM到150nM），根据自己的具体应用对探针进行优化。
现成的PCR****引物能用于RPA****么？
多半不行。绝大多数PCR引物不能用于RPA，因为它们太短了重组效率低。
现成的PCR****探针能用于RPA****么？
不能。绝大多数常用的PCR探针并不适合RPA反应。特别是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这样的酶活性与RPA根本不兼容。
怎样才算是好引物？我应该怎样设计RPA****引物？
RPA引物还没有一个严格的设计标准，所以需要进行筛选。（引物设计具体参见： PCR替代技术，RPA全攻略之引物设计 ）
RPA****引物需要多长？
RPA引物一般在32至35个核苷酸之间。某些情况可能用到少于30个核苷酸的引物，但扩增过程会显着减缓。
RPA****引物应当相距多远？
这取决于你的具体应用。标准TwistAmp®试剂盒适用于不超过500bp的扩增产物。RPA扩增产物的大小是没有下限的，不过RPA引物一般需要扩增子超过80bp。扩增产物在100-200bp之间，可以实现最快的RPA扩增。
在特定条件下，RPA扩增产物能够达到2kb。不过，目前的TwistAmp®试剂盒无法生成这么大的片段。
我需要筛选多少引物？
这取决于你对检测灵敏度的要求。举例来说，如果目标分子上千，那么绝大多数引物都够用了。对灵敏度要求很高的话，最好是进行系统性的引物筛选。一开始筛选的时候，候选引物可以有10到20对。测试的引物越多，找到好引物的几率也就越大。
筛选引物的时候必须用探针么？
不一定。任何检测方法都可以用来评估候选引物的性能。不过对于筛选高灵敏度引物来说，用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也最省力的方法。
引物筛选时应该用什么样的条件？
引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件，例如模板的拷贝数、样本纯度等等。
给定引物的性能还能再提高么？
一般来说，稍微改动一下引物的序列可以提高其RPA性能。任何给定的引物都可以通过以下方法进行优化：以单核苷酸为基础略微改变引物的长度；或者保持引物长度不变，以1bp为基础移动引物的位置。经过了改动的引物，需要重新进行扩增活性的测试。
RPA****引物的熔解温度应该是多少？
RPA反应是在常温下进行的，DNA的解链与PCR有很大不同。传统估算的熔点不适用于这个系统。
RPA****引物需要特别纯化么？
在进行引物筛选的时候，一般不需要纯化。在其他情况下，引物的质量会造成批次间的差异。如果对一致性要求比较严格，最好先纯化引物再进行RPA反应。
经过一种TwistAmp®****试剂盒测试的引物，能直接用于其它TwistAmp®****试剂盒么？
不一定。举例来说，经TwistAmp®基础试剂盒测试的引物，不能直接用于exo或nfo试剂盒，因为exo和nfo还要把探针纳入考虑。另外，跑胶检测、荧光检测或侧流层析检测对引物有不同的要求，不能一概而论。DNA检测和RNA检测也一般不能共用引物，因为逆转录酶和聚合酶有着不同的偏好。
我要怎么选择探针？
TwistAmp官网上提供有不同检测探针的设计指南。需要注意的是，TwistAmp® exo探针有一些特殊的限制。TwistAmp® fpg的探针设计更为灵活，但它生成的荧光信号没有TwistAmp® exo探针强。
使用引物和探针的时候还需要注意些什么？
引物和探针需要同时添加到体系中，一先一后会使片段重组出现偏向性。
㈡ RPA的应用领域有哪些
RPA可以用来干什么?(RPA应用范围)
核酸检测革命：可替代PCR的犀利技术——RPA
RPA对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。以下为大家介绍RPA在细菌、病毒检测以及癌症研究等领域的应用情况。
RPA成为致病菌检测的得力工具
在今年发表的一系列文章中，RPA技术被广泛用于艰难梭状芽孢杆菌、结核杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙门氏菌、大肠埃希菌STEC等常见致病菌的检测。在临床诊断和食品安全方面，为人们提供了简单快速的实地筛查方案。
RPA技术建立沙眼衣原体快速检测方法
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)感染是最常见的性传播疾病之一。沙眼衣原体影响5-10%的人口，常见于小于25岁的成年人。目前广泛使用的沙眼衣原体检测方法是以聚合酶链反应(PCR)技术为基础，这种方法只适合于经过专业训练的人员在具有特定仪器的实验室使用。
日前，发表在《分子诊断杂志杂志上的一项研究中，研究人员利用RPA技术开发了一种检测沙眼衣原体的快速、灵敏的新方法，利用该方法在20分钟内即可得出检测结果。
研究人员利用RPA技术直接从患者尿液样本中检测沙眼衣原体，不需要从尿液样品提取总DNA，也不需要专门的仪器设备。而且该检测方法还具有少费力、少耗时、更经济等特点。与目前的沙眼衣原体检测方法比较而言，该方法还能够显着提高检测的敏感性和特异性
RPA检测疟原虫
澳大利亚科学家首次捕捉到疟原虫入侵并摧毁人体红细胞画面
核酸扩增是目前最灵敏的疟原虫(P. falciparum)特异性检测法。然而，PCR需要热循环设备和专业性操作，资源匮乏的地区往往难以满足这些条件。在这种情况下，与侧流层析结合的RPA有着很大的应用前景。
杂志今年三月份发表的一项研究中，研究人员将RPA基础反应、TwistAmp nfo探针和侧流层析结合起来，实现了疟原虫18S rRNA基因的高灵敏度快速检测。在38°C的条件下，只需要不到十分钟的扩增，就能检出含有四个疟原虫的样本。加上侧流层析的检测时间，整个流程总共只需要15分钟，而且肉眼可以直接看到检测结果。
研究人员用不同疟原虫测试了这种方法的灵敏度和特异性。研究显示，所有疟原虫都被成功检出，所有非疟原虫都得出了阴性结果。文章指出，这一方案将大大改善资源匮乏地区的疟原虫分子诊断。
RPA检测冠状病毒
2012年在中东首次鉴定的中东呼吸综合症冠状病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一种新型的冠状病毒。这种病毒很快传入了欧洲，给公共安全机构敲响了警钟。
目前，MERS-CoV检测主要依赖于实时RT-PCR，需要收集患者样本然后到专门的实验室去检验。因此，亟需能够进行实地检测的快速装置。
《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月发表的一项研究，开发了一个能在3-7分钟内鉴定MERS-CoV的便携式RT-RPA装置。在42°C条件下，等温MERS-CoV RT-RPA与实时RT-PCR一样敏感，可检出10个RNA分子。文章指出，这个便携装置是监控MERS-CoV传播，寻找其动物宿主的理想方法。
RPA检测埃博拉等十种致命威胁
检测传染性疾病的综合panel，有助于资源匮乏地区进行实地分子诊断，对生物防御工作也有很大的帮助。
RPA检测HIV
RPA在癌症研究中的应用
㈢ TwistDx英文怎么读
twist [twɪst]迪死
核酸检测革命：可替代PCR的犀利技术
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。
重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。英国公司TwistDx Inc以此为基础开发的TwistAmp® 核酸扩增饥慎产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
RPA技术犀利在何处
常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37°C-42°C之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要兄高温控设备，RPA可以真烂尘敬正实现便携式的快速核酸检测。
据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。
RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。
目前，TwistAmp®试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度(便于定量)，甚至在更低的温度下进行反应。