丙肝酶联免疫法检测方法

‘壹’ 酶联免疫吸附测定的方法类型和操作步骤

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子（或受体）的水平。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）用脱脂奶粉或BSA进行封闭。洗涤除去多余的脱脂奶粉或BSA。
（3）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（4）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（5）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.

‘贰’ 酶联免疫法的检测步骤

ELISA用血清来检测，首先血液要经过至宏乱少半个小并庆时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止绝绝握液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。

‘叁’ 丙型肝炎病人的治疗方法

丙型病毒性肝炎有很多种类型，因此治疗方法也要因类型而异，在确定治疗方案时要判断丙肝患者是否是由丙肝抗体感染引起的，只有是由丙肝抗体感染的患者还要接受抗病毒的治疗。
阻断慢性丙肝的发展关键是进行病原丙肝的治疗方法，在控制和消灭病原的过程中，也应认识到必伴有肝组织的损害，病人应重视科学的检测。先进的检测技术可以帮助丙肝患者选择丙肝的治疗方法，帮助下一步治疗提供重要依据。
1、遗传学检查—HLA—A2检测：检测预后和药物的敏感度。
2、特异性免疫学检测：检测机体的免疫功能，制定恰当的治疗方案。
3、酶联免疫斑点法检测：检测患者免疫耐受的程度及对治疗方案的敏感度，以便及时调整治疗方案。
4、细胞分子生物学检测技术：检测病毒血清中的含量，观察用药过程中的疗效及是否出现耐药倾向。
一般的丙型病毒性肝炎患者是不需要抗病毒治疗的，但是根据肝脏受损的程度不同，治疗方案也有很大的差异，针对老年人和儿童、酗酒、吸毒等特殊人群的治疗方案更是各不相同，丙肝的治疗方法是根据丙肝患者的自身情况而制定的适合的治疗方案。

‘肆’ 初步诊断hcv的微生物学方法主要是

初步诊隐悄李断hcv的微生物学方法主要是采用免疫学的方法。根据查询相关运销资料可得出，诊断hcv所采用的免疫学的方法就是利用抗原抗体反应的特性来进行检测，比如酶联免疫法，化学发光法，金标法等，此外，现在还有采用常灶迟见的分子生物学的方法。

‘伍’ 丙肝病毒的生存和死亡条件,及特性.谢谢!

把我的备课笔记给你参考吧
一、生物学特性
（一）形态培养
HCV病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm ），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的包膜，包膜上有剌突。HCV体外培养尚未找到敏感有效的细胞培养系统，但黑猩猩对HCV很敏感。
（二）基因结构：
HCV-RNA大约有9500－10000bp组成，5′3′非编码区（NCR）分别有319-341bp，和27-55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框（ORF），其中基因组排列顺序为5'-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3',能编码一长3014个氨基酸的多聚蛋白前体，可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自独立病毒蛋白，即三种结构蛋白，为分子量19KD的核衣壳蛋白（或称核心蛋白，C）和33KD（E1），72Kd（E2/NS1）的糖蛋白，及四种分子量为23KD、52KD、60KD、116KD的非结构蛋白分别与NS2、NS3、NS4、NS5相对应。由于GP72正好与瘟病毒表面蛋白或黄病毒第一个非结构蛋白（NS1）相对应，故将GP72的基因标记称谓E2/NS1。E1和E2/NS1糖蛋白能产生抗HCV的中和作用。NS2和NS4的功能还不清楚，发现与细胞膜紧密结合在一起。NS3蛋白具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，以协助RNA复制，NS5有依赖于RNA的聚合酶活性，参与HCV基因组复制。
(三)变异性：
HCV具有显着异源性和高度可变性，对已知全部基因组序列的HCV株进行分析比较其核苷酸和氨基酸序列存在较大差异。并表现HCV基因组各部位的变异程度不相一致，如5′—CR最保守，同源性在92-100%，而3′NCR区变异程度较高，在HCV的编码基因中，C区最保守、非结构（NS）区次之，编码包膜蛋白E2/NS1可变性最高称为高可变区。
(四)基因分型：
HCV基因分型还无统一标准，因用于基因分型的部位和采用的技术方法不同，出现了各种基因分型结果，但各种基因型分类方法之间有一定的对应关系。
现知欧美国家多数HCV-Ⅰ型感染，而亚洲国家以Ⅱ型为主，Ⅲ型次之。Okomoto报告日本慢性丙型肝炎患者和健康献血员主要为Ⅱ型感染，分别占59.3%和82.4%,而血友病人约50%为Ⅰ型感染，原因是应用输入美国进口凝因子Ⅷ。Wang氏报告我国北京慢性丙型肝炎患者86.2%为Ⅱ型感染，Ⅲ型感染为13.8%。而新疆病人Ⅲ型感染却占50%，说明不同型HCV具有一定的地区和人群分布特征。此外不同基因型感染引起临床过程和干扰素治疗反应亦表现不同，如Ⅲ型感染临床症状较重,有引起严惩肝病倾向：Ⅱ型(Simmonds 1b)感染对干扰素治疗不敏感效果差。Ⅲ型感染（Simononds 2a）用干扰素治疗效果好。
二、致病性与免疫性
丙型肝炎的传染源主要为急性临床型和无症状的亚临床病人，慢性病人和病毒携带者。一般病人发病前12天，其血液即有感染性，并可带毒12年以上。HCV主要血源传播，国外30-90%输血后肝炎为丙型肝炎，我国输血后肝炎中丙型肝炎占1/3。此外还可通过其他方式如母婴垂直传播，家庭日常接触和性传播等。
输友御入含HCV或HCV-RNA的血浆或血液制品，一般经6-7周潜伏期例急性发病，临床表现全身无力，胃纳差，肝区不适，1/3病人有黄疸，ALT升高，抗好坦岩HCV抗体阳性。临床丙型肝炎病人50%可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会导致肝硬及肝细胞癌。其余约半数病人为自限性，可自动康复。
丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，当HCV在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明HCV直接损害肝脏，导致发病起一定作用。但多数学者认为细胞免疫病理反应可能起重要作用，发现丙型肝炎与乙型肝炎一样，其组织浸润细胞以CD3+为主，细胞毒T细胞（TC）特异攻击HCV感染的靶细胞，可引起肝细胞损伤。
临床观察资料表明，人感染HCV后所产生的保护性免疫力很差，能再感染不同，甚至部分病人会导致肝硬信颂化及肝细胞癌。其余约半数病人为自限性，可自动康复。
丙型肝炎发病机理目前仍未十分清楚，当HCV在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明HCV直接损害肝脏，导致发病起一定作用。但多数学认为细胞免疫病理反应可能起重要作用，发现丙型肝炎与乙型肝炎一样，其组织浸润细胞以CD3+为主，细胞毒T细胞（TC）特异攻击HCV感染的靶细胞，可引起肝细胞损伤。
临床观察资料表明，人感染HCV后所产生的保护性免疫力很差，能再感染不同株，甚至同株HCV。可能与HCV感染后病毒血症水平低及HDV基因级变异性有关。
三、微生物学诊断
(一)放射免疫诊断（RIA）或酶联免疫试验（ELISA）检测血清中抗HCV
1989年，Kuo等建立了抗-C-100放射免疫试验方法（RIA），随后Ortho公司又研制成功酶联免疫试验方法（ELISA）检测抗-C-100。这两种方法均用重组酵母表达的病毒抗原（C-100-3，为NS4编码的蛋白，含363个氨基酸），经纯化后包被微量塑料板孔，然后加被检血清，该病毒抗原即与被检血清中抗-C-100结合，最后加同位素或酶标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，加底物显色判断结果。
用上述酶联免疫试验法（ELISA）检测抗-C-100有如下缺点：1. 抗-C-100出现较晚，约半数输血后丙型肝炎病人于输血后4～6个月抗—C-100首次阳转，因此，不宜作为急性丙型肝炎的常规实验室诊断；2.抗-C-100不是中和抗体，也不是IgM抗体，而是IgG 抗体； 3.本法不够灵敏，少数丙型肝炎病人检测不到抗-C-100；4.有非特异性，一些自家免疫性慢性肝病患者可出现假阳性，因此，抗HCV阳性需作重组免疫印迹试验（Recombinant Immune Blot Assay, RIBA, 或称 Western Blot）证实。
由于HCV核心抗体出现较早，因此，最近美国第二代酶联免疫试验法（ELISA）检测抗HCV。该试剂盒采用HCVC区编码蛋白C-22-3和非结构区NS3编码蛋白C-33-3和C-100-3包被载体。用本法检测抗HCV，其检出率可提高25～30%，且检出抗HDV的时间也可提早16～42天。
（二）免疫组化法检测肝组织中HCV抗原
感染HCV的黑猩猩或病人血清中提取IgG，用间接免疫荧光或间接免疫酶组化法检测肝内HCV抗原。
四、防治原则
丙型肝炎的预防方法基本与乙型肝炎的相同。目前，我国预防丙型肝炎的重点应放在对献血员的管理，加强消毒隔离制度，防止医源性传播。
国外报告，对献血员进行抗HCV筛查，可排除85%具有HCV传染性的献血员，从而明显降低输血后丙型肝炎的发病率。由于献血员抗HCV阳性率与ALT水平和抗-HBc是否阳性有关，ALT（丙氨酸转移酶）异常和抗HBc阳性者抗HCV阳性率明显高于ALT正常和抗HBc阴性者（44%：0.5%），因此，在目前尚无条件进行抗HCV筛查的地区，可对献血员作ALT和抗HBc筛查。据报道，排除ALT异常的献血员后，输血后丙型肝炎发病率可下降47.4%；排除抗HBc阳性的献血员后，输血后丙型肝炎发病率下降33%；如上述两项指标异常的献血员均被排除，则输血后丙型肝炎发病率可下降61.2%。
最近，美国疾病控制中心报告，经皮肤感染丙型肝炎病人血液者，于暴露后立即注射免疫蛋白（0.06ml/kg）可能有预防作用。
本病的最终控制将取决于疫苗预防。HCV分子克隆的成功，为本病的疫苗预防提供了可能性，未来的丙型肝炎疫苗应包括各种不同重组的HCV毒株，或根据各地流行的HCV毒株来构建丙型肝炎疫苗。
干扰素治疗丙型肝炎，可缓解病情，防止约1/2急性丙型肝炎向慢性化发展，慢性丙型肝炎用IFN治疗后有效率为50%，但有半数复发，维持有效率为20-25%。

‘陆’ 丙肝的检查方法有哪些

丙型肝炎是由丙肝病毒所引起，是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。
丙肝检查方法都有哪些呢?
1. Anti-HCV(丙肝抗体检验)：抗体是由于人体免疫细胞对病毒感染或疫苗所做出的反应而产生的。抗体在血液中循环而且通常终生都会存在。丙肝抗体检验就是通过检验丙肝抗体的存在，来确定之前病毒的存在，而不是检验病毒本身。
由于从丙肝病毒的入侵到丙肝抗体的产生大约需要三个月，所以在感染丙肝的最初三个月，可出现假阴性。如果一个人有着比较差的或者被抑制的免疫系统(像艾滋病此雹导致的情况那样)，也可能会产生假阴性结果，因为机体不能产生抗体。因此，免疫系统差的人应该通过核酸PCR试验来检验是否得了丙肝。
2.HCV-RNA(聚合酶链反应测试(PCR))：这个测试是探测血液中丙肝病毒的实际存在情况。这是一个很灵敏的测试，可以在感染两星期内检测到病毒。HCV-RNA测试有两种：
a) 定性：这是最灵敏的测试，很容易就可以检测到病毒是否存在于血液中。检测的结果要么是阳性(指病毒存在)要么是阴性(指未检测到有病毒)
b) 定量：这个测试是衡量存在于血液中的病毒总量(也称病毒载量)。检测的结果是有多少个“拷贝”。
丙肝怎么检查呢?
丙肝的检查首先必须明确感染丙型肝炎病毒，不一定就患丙型肝炎，因为丙型肝炎也存在无症状病毒携带者，他们一般没有明显的肝脏损害。诊断丙型肝炎主要包括两个方面：一是丙型肝炎病毒的标志物是否为阳性，二是有无肝脏损害及损害的严重程度。
病毒标志物主要包括血清抗—HCV(抗丙型肝炎病毒抗体)和HCV RNA(丙型肝炎病毒核糖核酸)。肝脏损害的检查主要包括肝功能、B超及肝脏病理组织学的检查。丙肝病毒指标阳性加上肝功能损害的指标，即可明确诊断为丙型肝炎。
假如只有丙肝病毒指标阳性，而未发现任何肝脏功能损害的证据，尤其是肝活检组织病理无明显肝细胞破坏时，则诊断为丙肝病毒无症状携带者。正确诊断丙肝，全面把握病情是了解丙型肝炎的病情转归与预后的重要前提。
丙肝检查项目都有哪些呢?
丙肝检查项目有：血清生化学检查项目、丙肝抗体检查项目、丙肝病毒RNA检查以及肝脏病理学检查。
1、血清生化学检测，其水平升高可能与肝脏炎症反应有关。
2、丙肝抗体检测，丙肝抗体检测是用于诊断丙肝的最重要手段，适用于高危人群的筛查，也可以用于丙肝感染者的初次筛查。
3、丙肝病毒RNA检测，病毒基因检测是检测血液中丙肝病毒的实际存在情况，可在感染2周内检测到病毒。
4、肝脏病理学检查，肝脏病理组织学检查对于丙肝的诊断、衡量肝脏炎症和纤维化程度、评估药物疗效等均非常重要。
丙肝传染途径是什么呢?

丙型肝炎此州病毒简称丙肝，为黄病毒科丙型肝炎毒属病毒。HCV是一个大小为30-80nm的单股正链RNA病毒，基因组长度为904kb。目前，全世界以发现10个以上的HCV基因型和亚型，我国北方以阿拉伯数字3/2a型为主，南方以阿拉伯数字2/1b型为主。
传播途径以经血液传播途径为主，可经输入染有病毒的血液。血制品或森扒帆使用染有病毒的注射器材及医疗器具等传播。母婴传播是重要的传播途径，包括经胎盘、分娩、哺乳等方式传播。家人之间日常生活的密切接触也是重要的传播途径。

‘柒’ 什么是酶联免疫法酶联免疫试剂盒如何使用

酶联免疫试剂的基本原理 酶联免疫试剂 http://www.cusabio.cn/ 测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。 它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

‘捌’ 酶联免疫法的检测方法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
⑴已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；⑵酶标记的抗原或抗体（结合物）；
⑶酶的底物；
⑷阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
⑸酶联物（结合物）及标本的稀释液；
⑹洗涤液；
⑺酶反应终止液。

‘玖’ 酶联免疫检测的方法及原理是什么

（1）酶联免疫吸附试验（,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
（2）夹心法（sandwichassay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法（indirecrELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidinsystem-ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

‘拾’ 第二代酶联免疫试验法（ELISA）检测抗HCV是什么原理

原理都一样都是间接法，只不过是固相包被成分不一样，第一代试剂利用来自HCV病毒基因组中的部分NS3和NS4区重组表达抗原（C100）作为固相包被进行检测；第二代试剂利用来自HCV基因组NS3区的C33C和部分NS4区的融合表达抗原（C200）、再加上C区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测；第三代试剂在第二代抗原的基础上，又加入了来自NS5区的重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进了合成肽抗原。