细胞干性的检测方法

1. 细胞活性检测的方法有多少种

细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、 3H 放射性同位素掺入法、 MTT 法等。其中 MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的 Formazan ，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如 XTT 、 CCK-8 （ WST-8 ）等。

2. 怎样验证一个细胞是干细胞

常用类胚体、畸胎瘤或嵌合体三种实验方法验证 。
以小鼠干细胞为例
类胚体实验：干细胞在悬浮培养时，培养基中不添加LIF（一种分化抑念银仿制剂），静下观察会发现细胞形成的球状细胞团并相互融合，中心由于缺少养分死亡搏腊形成空腔。
畸胎瘤实验：将干细胞注射到同品系小鼠的背部仔纤皮下，会形成有三个胚层的畸胎瘤。
嵌合体实验：将干细胞注射到同品系小鼠胚胎的囊胚腔中，出生后检测该小鼠的遗传物质会发现有些细胞是由注射的干细胞分化而来的。

3. 细胞免疫功能检测常用有哪几种方法

细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化。
一、迟发型过敏反应的体外检测方法
皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。
1．皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。
2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。
二、细胞免疫的体外检测方法
体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。
1．T细胞计数
（1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5～10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。
（2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3 细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%～80%。正常人的CD4 细胞和CD8 细胞之和应与CD3 细胞数一致。CD4 细胞与CD8 细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。
2．T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数。
3．细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50：1或100：1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。
细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。
4．混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4～5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时，然后测定清液中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时，特别是AIDS病人，IL-2分泌明显降低。而有些疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2水平升高，表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶联免疫吸附试验测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体（CD25），一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的，IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测，如移杆排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治疗的病人。
对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查细胞培养上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的cDNA探针作分子杂交试验，即印迹（dot blotting）或Northern印迹，若查出有某种因子的mRNA存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。

4. 解螺旋24型-第1型增殖

一、增殖

表型的最大特点就是可以通过特定的实验手段进行检测

研究层次：人群→动物→组织→细胞→分子

1、分子层面：MCM，PCNA，Ki-67

①直接相关：免疫组化（最常用）PCNA、Ki67（较特异地存在增殖细胞中,但Ki67 G1期不存在，营养缺乏时表达上升；PCNA，由于“ DNA修复”误认为是“增殖” ）， PCNA、Ki-67、MCM（MCM最优） ；

微小染色体维持蛋白，minichromasome maintenance protein，MCM，只在细胞的增殖期才能够检测搜和到，它的表达在 G1/S转粗漏丛换点达到峰值 ，在分化期和静息期时，表达缺失

Ki-67，细胞核相关抗原，在细胞的G0期不表达，G1中期到后期出现表达， S期和G2期表达逐渐增加，有丝分裂期达到高峰

PCNA，增殖细胞核抗原，周期素，参与DNA损伤的修复和间接参与细胞周期的调控，P21是CDK的抑制因子。在G0/G1期几乎没有表达，G1晚期表达大幅度增加， S期达到高峰 ,G2/M期表达下降。

②间接相关：检测肿瘤干细胞分子marker （如胰腺癌干细胞的CD44） ，存在争议，锦上添花；

拓展：干细胞检测实验 “干细胞悬浮成球试验”（microsphere formation assay）， 能在离体条件下，形成微球/悬浮球（microsphere），是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。

检测抑癌基因， 最常见P53，PTEN表达水平下降（western、qPCR） ，提示肿瘤恶性岩樱程度上升，增殖表型↑

2、细胞层面：

MTT法；原理：活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶 能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶 甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，最后用酶标仪在特定的波长处，测定光吸收值，可间接反映活细胞的数量。在做MTT实验的时候，通常取5个时间点（通常就是5天）。把5天中每一天的吸光度数据都记录下来，最后形成一条细胞增殖的曲线。通过比较不同处理方式或者不同实验组之间，细胞增殖曲线的高低，就可以判断细胞增殖情况的快慢。

CCK8法：MTT衍生，原理类似

BrdU染色法；BrdU是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的DNA，可以代替胸腺嘧啶，选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。Br特异性抗体+免疫荧光染色可以用于检测Br在细胞DNA中的渗入，从而判断细胞增殖能力/动力（影像）的变化。

E染色法：；BrdU衍生，原理类似

RTCA法（real time cell analyzer），实时细胞分析仪，利用RTCA实时细胞分析仪，当细胞在孔内发生粘附，转移，增殖的时候，孔内的电阻抗发生变化，被电极实时记录，研究者也就获得了相关的实时数据。采用这种RTCA的方法，不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附、凋亡、转移等等，应用范围广；

RTCA 是实时记录，实时记录的好处就是，不仅能够获得关键时间点的细胞增殖数据，而且还可以获得在整个培养周期内的细胞增殖动力学变化过程

克隆形成实验（不常用）：以评估肿瘤细胞的离体增殖能力的大小以及肿瘤在体外的致瘤能力的大小；

干细胞悬浮成球实验

3、组织层面：降低维度，回到细胞生物学和分子生物学层面免疫组化；形态学，检测细胞形态和组织结构上的差异。但是从总体而言， 从石蜡样本当中， 能够获得mRNA和蛋白的可能性很小，但是通过石蜡样本可以获得比较好质量的 DNA样本和miRNA样本 。！注意区分肿瘤区域和癌旁区域！存放于 深低温冰箱（-80 度） 中的新鲜组织样本只要保存方法合适，是可以从新鲜组织样本中获取蛋白，或者是mRNA/lncRNA样本，可以用于后续的 western实验或者qPCR 的实验。

4、动物层面：移植瘤动物模型，肿瘤大小、体积、重量 反映增殖最直观的数据；组织形态：移植瘤的中心部分形成部分组织和细胞的坏死，移植瘤恶性增殖程度越高，移植瘤内部形成坏死的区域也会愈加的明显。降低维度，匀浆后检测蛋白水平（western）、RNA（实时定量PCR）等；石蜡切片可获得高质量的DNA和miRNA样本， 注意区分肿瘤区域和癌旁区域。

有了动物模型的移植瘤样本之后，检测增殖相关的分子标志物，可以有多种方法。

第一种常见的方法是，把移植瘤的样本，通过匀浆的方式 抽提总的蛋白或者是总的RNA ，检测增殖相关的分子标志物蛋白水平的变化或者是RNA水平的变化。检测蛋白可以用western blot；检测RNA水平的变化，可以用实时定量PCR的方法。如果对于移植瘤样本，不进行匀浆，不抽提总蛋白或者总的RNA，而是对移植瘤样本进行组织切片，然后通过 免疫组化的方法，检测切片样本当中，PCNA 以及Ki-67 等增殖相关分子标志物 的表达变化，也能达到类似的效果。

在移植瘤的样本当中，还可以检测细胞的组织形态。因为肿瘤细胞会发生不受控制的恶性增殖，会导致移植瘤的中心部分，由于肿瘤细胞的密度过高，无法接触到外界的氧气和养分，会使移植瘤的中心部分形成部分组织和细胞的坏死。移植瘤恶性增殖程度越高，移植瘤内部形成坏死的区域也会愈加的明显。所以可以通过移植瘤的组织切片，检测移植瘤内部坏死区域的面积大小，评估肿瘤恶性增殖程度的强弱。

总结：

增殖是最常见的表型，可以从分子/细胞/组织/动物 四个层面上进行相关检测。

在分子层面上 ，常见的有三个PCNA，Ki-67 和MCM。还有两类和增殖间接相关的分子标志物：一类是干细胞相关的分子标志物；另一类是检测抑癌基因，但相对不太常用。

缺点：Ki67在G1期不存在，营养缺乏时表达上升；PCNA，由于“ DNA修复”误认为是“增殖”

在细胞层面上 ，常见的方法有：1）MTT 比色法；2）Br 染色法；3）RTCA（real time cell analyzer，实时细胞分析法），其中MTT比色法和Br染色法是经典方法，RTCA 对于硬件设备的要求很高，成本高昂。检测克隆形成，可以使用克隆形成实验（colony formation assay）。

MTT原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒。

RTCA不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附、凋亡、转移等等，应用范围广。

在组织层面上 ，1）可以通过免疫组化的方法，检测增殖相关的分子标志物（PCNA，Ki-67 和MCM）；也可以取新鲜组织做western或qPCR，但注意区别肿瘤区域和癌旁区域；2）通过形态学，检测细胞形态和组织结构上的差异。

在动物层面上， 检测增殖表型最常用的动物模型是移植瘤动物模型，记录 移植瘤的大小 / 体积，重量等参数 。通过动物的移植瘤样本，同样可以检测增殖相关的 分子标志物 。另外，由于移植瘤中，细胞发生急剧的增殖，会导致移植瘤内部因为缺少氧气和养分而形成坏死区域，通过形态学检测移植瘤 内部的坏死区域，也是评估增殖的有效手段 。

5. 细胞活性和细胞毒性检测的实验方法

细胞数量确定

1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。

2.向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。

3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。

4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

细胞增殖和细胞毒性测定

1.将种子细胞以103-104个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养。将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。

2.将不同浓度的待测物质加入板中。

3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。

4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。

5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。

6.在读取孔板之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。

7.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

数据分析

统计分析有几种方法，您可以选择使用O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。

细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。

Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作标准曲线

1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。

2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）

3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100 μl培养基加入10 μl CCK-8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。

可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

注意事项

1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。

2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。

3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。

4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。

5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

6. 孵育2小时后，背景O.D.值一般为0.1-0.2单位。

7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值。

8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用0.2 μm的膜过滤溶液。

9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达4小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。

10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在600nm或更高波长的O.D值。

11. CCK8不能用于细胞染色。

12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

13. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）

14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。

15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。

16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。

17. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片, 450nm滤光片具有最佳灵敏度。

18. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。

19. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、 90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。

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6. 细胞增殖

增殖是一种在生物医学领域内， 非常伏源常见的表型， 甚至可以说是最常见的一种表型。

细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。 高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式： 有丝分裂。 有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。 在有丝分裂的过程中， 2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后， 产生两个都是 2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式， 被称为减数分裂。 减数分裂最大的特点是， 2倍体的性生殖细胞， 经过减数分裂后， 形成 2 个单倍体的后代细胞。 由于细胞在分裂前是 2 倍体， 而分裂后变成了单倍体， 使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半， 因此得名“减数分裂” 。

增殖是最为常见的表型。 无论是正常生理条件下， 还是异常的病理条件下， 无论是正常的细胞， 还是异常的细胞， 增殖现象都是普遍存在的。

一.增殖表型如何检测？

1.分子层面检测增殖表型

有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系， 因此， 只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。 这类分子就是增殖的 marker 分子。

常见的和增殖相关的 marker 分子有如下几种：

（1） 与增殖相关的分子标志物

A) MCM （微小染色体维持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在于真核细胞中。 MCM 在有丝分裂的晚期和 G1 期与染色质紧密结合， 在 S 期和G2 期分开。 MCM 蛋白只在细胞的增殖期才能检测到， 它的表达在 G1/S 转换点达到峰值， 在分化期和静息期时， 表达缺失， 因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。

B) 细胞核相关抗原 Ki-67。 这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物， 最早在 1983年在增殖细胞中发现， 目前在病理诊断中使用非常地广泛。 Ki-67 的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白， 所以目前对于 Ki-67 的功能了解得不多。 推测它可能具有如下的几个功能： 1） 推测 Ki-67 可以调节细胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 发 生相互结合； 3） Ki-67 在细胞分裂期参与合成核糖体。 Ki-67 在细胞的 G0 期不表达，G1 中期到后期出现表达， S 期和 G2 期表达逐渐增加， 有丝分裂期达到高峰， 细胞禅厅弯分裂后迅速降解。

C) 增殖细胞核抗原 PCNA。 PCNA 又称为周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白。 这个分子也是经典的增殖相关分子标志物， 最早在 1978 年就有所报道。贺闷 又因为 PCNA 出现在增殖期细胞的细胞核中， 所以被称之为增殖细胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的辅助蛋白； 2） 参与 DNA 损伤的修复； 3） 参与细胞周期的调控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通过和 p21 相互作用， 间接影响细胞周期和增殖。 在增殖细胞的细胞周期中， PCNA 的量会发生明显变化， 它在 G0/G1期几乎没有表达， G1 晚期表达大幅度增加， S 期达到高峰,G2/M 期表达下降。 PCNA 也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。

PCNA 和 Ki-67 作为细胞增殖标志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表达， 因此在整个细胞周期过程中， 存在表达时间上的间隙。 另外 PCNA 在DNA 修复和复制过程中， 发挥了作用， 这会导致结果的“假阳性”。 就是说某些没有发生增殖， 但是发生了 DNA 修复的细胞， 也会上调 PCNA 的表达， 这会让研究者误以为细胞发生了增殖。 Ki-67 也会有类似假阳性现象的存在， 比如说 Ki-67 的表达水平， 会受到外部因素的影响， 比如在营养缺乏的时候。 MCM 蛋白相对于 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的优势在于整个细胞周期中都有表达， 而且它不受 DNA 损伤修复和其他外部因素的影响。 因此有的研究者认为， MCM 蛋白是优于 PCNA 和 Ki-67 的理想的细胞增殖标志物。 但是从实际的应用层面看， 无论是在临床应用当中， 还是在基础科研当中， PCNA 和 Ki-67 的应用， 都更加广泛。

（2） 和干细胞相关的分子标志物

根据肿瘤干细胞的理论， 肿瘤干细胞是肿瘤中， 具有自我更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖， 维持了肿瘤细胞群的生命力。 因此， 如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测， 证实肿瘤干细胞的数量增加， 这就提示肿瘤的恶性程度高， 间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。 例如， CD44 是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物， 因此可以通过检测 CD44 的表达水平， 证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况， 间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。 但是采用这种方法是具有局限性的， 因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。 而且在很多肿瘤当中， 肿瘤干细胞的标志物， 还存在很大的争议。所以我个人的建议是， 直接检测 PCNA 或者 Ki-67 之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物， 只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况， 只能算是锦上添花而已。

（3） 检测抑癌基因

检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物， 它存在着如下的一种逻辑推理的过程， 首先， 在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降， 就提示肿瘤的恶性程度明显提升， 间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。 在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个： p53 和 PTEN。 经常可以看到在论文当中， 通过 western 或者 qPCR， 证实 p53 以及 PTEN 分子表达水平降低， 从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升， 肿瘤的增殖表型也会显着的提升。

2.细胞层面检测增殖表型

（1） 直接检测细胞的增殖状态

A） 最为经典的方法是 MTT 法。 MTT 是一种染料。 它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒， 最后用酶标仪在特定的波长处， 测定光吸收值， 可间接反映活细胞的数量。 MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。 后续基于类似的实验原理，还在 MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如 CCK8染色实验等等。 在做 MTT 实验的时候， 通常取 5 个时间点（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来， 最后形成一条细胞增殖的曲线。 通过比较不同处理方式或者不同实验组之间， 细胞增殖曲线的高低， 就可以判断细胞增殖情况的快慢。

B） 另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是 Br 染色法。 Br 是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。 这种渗入可以稳定存在， 随着 DNA 的复制， Br 可以进入子代细胞中。 Br 特异性抗体可以用于检测 Br 在细胞 DNA 中的渗入， 从而判断细胞增殖能力的变化。 通常在使用 Br 单克隆抗体之后， 都会结合免疫荧光染色， 显示增殖的细胞， 同时结合其他细胞标记物， 进行双重染色， 可以判断增殖细胞的种类， 增殖细胞的增殖速度， 对研究细胞动力学有重要的意义， 因为组织细胞内没有内源性 Br 的存在， 所以这种方法用于检测细胞的增殖， 应用非常广。 另外， 通过 Br 染色法可以提供影像学相关的数据， 这比单纯采用MTT 法（只能提供简单的折线图） ， 要更富有视觉效果。 基于 Br 染色方法， 又演化迭代出 E 的染色方法。 E 也是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在 DNA 复制时期代替胸腺嘧啶， 渗入正在合成的 DNA 分子中。 而且在检测的时候， 直接采用荧光染料与 E 特异性反应， 直接准确地检测出 DNA 复制活性， 能更有效地检测细胞增殖现象。

C) MTT 法或者 Br 染色法， 这类技术都属于 End-point assay（终点分析法） 。 因为这类技术对于细胞都有破坏作用， 在检测过程中， 细胞已经死亡， 结构也不再完整。 因此， 有公司（例如罗氏） 研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法， 这种设备成为 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 这类技术的特点就是实时（real time） 。 RTCA 实时细胞分析仪， 需要用到特定的细胞培养板（被称为 E-plate） ， 在 E-plate 每一个孔的底部都含有特制的电极。 电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electric impedance） 。 当细胞在孔内发生粘附， 转移， 增殖的时候， 孔内的电阻抗发生变化， 被电 极实时记录， 研究者也就获得了相关的实时数据。 不过需要特别强调的是， 采用这种 RTCA的方法， 不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取， 也可以用来检测细胞的黏附， 细胞的凋亡、细胞的转移等等， 所以它的应用范围是非常广的。

（2） 检测细胞的克隆形成能力

肿瘤细胞由于恶性程度高， 因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。 正常细胞在增殖的时候， 需要细胞与细胞之间的信号传递。 这些信号的存在， 使得正常细胞增殖过程中， 可以有序地受到调控。 但是肿瘤细胞具有高度的恶性， 它的增殖是不受调控的， 所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路， 肿瘤细胞也可以由单独一个细胞， 增殖形成大量的子代细胞， 最终形成一个细胞克隆。 这种现象就被称之为克隆形成能力， 可以通过克隆形成实验， 加以检测。

对于干细胞， 也有一种类似于克隆形成实验的技术， 用于检测干细胞的增殖能力， 这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验” （microsphere formation assay） 。 鉴定干细胞需要很多的指标， 能在离体条件下， 形成微球/悬浮球（microsphere） 是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。

3.组织层面检测增殖表型

（1） 检测分子标志物

临床上最容易获得的组织样本， 通常都是石蜡切片。 基于石蜡切片， 可以进行免疫组织化学IHC 的研究， 检测和增殖相关的分子标志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。

（2） 细胞形态和组织结构上的差异

在临床组织样本当中， 除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外， 还可以通过形态学的方式， 检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。

通过石蜡切片的染色实验， 可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。 而且即便是同一种肿瘤， 在相同的组织部位， 肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致， 很不均匀， 有时甚至会出现巨细胞。 在有些肿瘤细胞的细胞核内， 会出现细胞核体积增大的现象， 这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。 肿瘤细胞的细胞核大小， 形状都很不均一， 甚至会出现巨核、双核、 多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。 通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。

正常组织当中， 是由很多不同类型的细胞所组成。 不同类型的细胞在组织内， 以特定的、 有序的排列顺序， 组成了健康的组织。 但是在组织内发生肿瘤之后， 由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖， 并且挤压了周围的正常细胞， 导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏， 组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。 通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测， 也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。

4.动物层面检测增殖表型

大部分的疾病类型都有与之相对应的， 可用于研究的动物模型。 在肿瘤研究当中， 用于研究增殖相关表型的动物模型， 最常见的就是移植瘤动物模型。

在移植瘤当中， 为了获取和增殖相关的表型， 通常要记录几个参数， 比较简单的有肿瘤的大小也就是体积， 其次是肿瘤的重量， 这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性， 最直观的数据。 有了移植瘤的样本之后， 我们还是可以通过降低维度的方式， 以移植瘤的样本作为检测对象， 检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。

二.总结

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7. 细胞活性检测的方法有多少种 每种的原理是什么

在目前的细胞活性检测方法中，MTT法是较早且较为经典的方法。但是，由于MTT法形成的甲物是非水溶性的，需要加有机溶剂溶解，这不仅增加了研究人员的工作量，也给实验带来了一定的误差。在这里我们向大家介绍一种国外最新检测方法—CCK-8法，它具有方便、灵敏、快速、无放射性、重复性好的特点。现在已广泛用于细胞增殖检测、细胞毒性检测、药物筛选、药敏试验等。

另外还将向大家介绍几种氧化应激和蛋白质抗体标记的新方法。
内容：
1、新型细胞活性检测方法介绍
2、国外氧化应激测定方法介绍
3、蛋白质抗体标记的新方法介绍

原理恕在下不知

8. 表皮干细胞的鉴别

利用干细胞最显着的两个特征即慢周期性及自我更新能力来鉴定在体与离体干细胞是最基本且可靠的实验手段。由于干细胞的慢周期性，可采用标记滞留细胞的分析方法识别在体的静息干细胞。干细胞的自我更新能力在体外培养则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆，从而识别离体的干细胞。但这两种方法应用不方便，目前利用仔陪表皮干细胞一些相对特异的标志建立了一系列的表皮干细胞鉴别方法[1]。
由于表皮干细胞及短暂扩充细胞表面高表达β1整合素，而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达β1整合素，因而可以用β1整合素的抗体来鉴别表皮干细胞及短暂扩充细胞。虽然表皮干细胞β1整合素的表达量约为短暂扩充细胞的两慎戚搜倍，但一般的光镜下尚不能依靠β1整合素阳性强度的不同来区分干细胞和短暂扩充细胞。如果利用激光共聚焦显微镜，将组织切片进行1μm的断层扫描，即在单层细胞水平上观察，则可以分辩出干细胞与短暂扩充细胞表达β1整合素阳性强度的差异[5，10]。
近来，有实验结合干细胞表面的α6整合素及另一个与增殖有关的表面标志10G7，可以区分干细胞与短暂分化细胞。检测发现α6阳性而10G7阴性（α6bri10G7dim）的细胞处于静息状态，在体外培养中具有很强的增殖潜能，证实为干细胞：而α6与10G7均阳性（α6bri10G7bri）的细胞是短暂扩充细胞，体外培养证实其增殖能力有限；α6阴性的细胞其角蛋白K10则呈阳性表达，说明是有丝分裂后终末分化细胞。因而可以利用α6整宽历合素与10G7的单抗来区分干细胞、短暂扩充细胞和分化的表皮细胞[10]。
角蛋白（Keratins）是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为10 nm的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同，表皮细胞表达不同的角蛋白，因而角蛋白也可作为干细胞、定向祖细胞、分化细胞的鉴别手段。表皮干细胞表达角蛋白19（Keratin19,k19），定向祖细胞表达角蛋白5和14（Keratin5、Keratin14,K5、K14），而分化的终末细胞则表达角蛋白1和10（Keratin1、Keratin 10，K1、K10）。实验证实表皮基底层中K19与β1整合素表达均为阳性的细胞是标志滞留细胞，具有干细胞的慢周期性。一般认为毛囊的隆突部干细胞及胎儿、新生儿表皮基底层干细胞均表达K19，成人无毛发皮肤如手掌、脚掌部位基底层的干细胞K19表达阳性，但有毛发皮肤基底层中的表皮干细胞K19则表达为阴性[11，12]。又有实验发现毛囊隆突部表皮干细胞表达角蛋白15（Keratin15,K15），而且在干细胞的分化过程中，K15表达的减少较K19表达的减少更早，K15阴性而K19阳性的细胞可能是“早期”短暂扩充细胞，故K15可能较K19在鉴别毛囊的隆突部表皮干细胞更有意义[13]。

9. 细胞活性检测的方法有多少种 每种的原理是什么

简单说几个把

1. 染色体法 主要在培养基中利用死活细胞对燃料亲和力不同 来判断

2. 克隆形成实验 原理是单个细胞在体外增至六代后，后代形成的细胞群体 ，通过计算其克隆形成率 来判断

3. 比色法 也是比较经典的 M,RR 活体细胞中的线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将M，rr还原成蓝紫色的结晶甲醋 死细胞无此功能
   

10. 怎么鉴定一个细胞是干细胞

干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚芹册胎干细胞和成体干细胞。升首则干细胞具有自我更新复吵棚制的能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。