检测培养基灭菌效果的常用方法

1. 培养基的配制与灭菌方法说明

培养基 （Medium）是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有水、氮源、无机盐（包括微量元素）、碳源、生长因子（维生素、氨基酸、碱基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。
不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。有些微生物，如自养型微生物，不需要碳源，所以上述物质只具有一般性。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般 培养基 必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在3-6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，均改制成粉末。

培养基的配制
1.配料
配方换算→在容器中加入少量水（蒸馏水，自然水）→按照配方称取各种药品（依次加入）→加足所需水量（一药一勺，取药后立即盖上瓶盖）。
2.溶解
淀粉溶解：少量冷水调成糊状加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95-97℃ ，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。
3.调PH
用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。
4.过滤
滤纸或棉花进行过滤。（有时可以省去）
5.分装
一般 培养基 放在三角瓶或试管中灭菌使用。
(1)三角瓶
若作静置培养，判含则100ml培养基/250ml的三角瓶，最多不能超过150ml培养基/250ml的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则15-20ml培养基/250ml的三角瓶，保证通气良好。
(2)试管分装
液体培养基一衫让般装4-5ml，约试管的1/4高度；固体斜面 培养基 一般装3-4ml，约试管的1/5高度。
6.包扎
分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。

7.灭菌
按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使 培养基 的颜色变深。
8.摆斜面
灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。
9.贮存
培养基 在30℃下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用。

培养基的灭菌

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
湿热灭菌有煮沸消毒法和高压蒸汽灭菌法两种，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min，对于芽孢则需煮沸约1～2h。
高压蒸汽灭菌法是高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

培养基注意事项
1、确认工作细胞库是否被污染，确认毒种工作种子批是否被污染，确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用细菌、掘塌笑真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验 培养基 的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。
2、其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。
3、另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。

2. 为检验高压蒸汽灭菌效果,目前常用的方法是

为检验高压蒸汽灭菌效果,目前常用的方法是高压蒸汽灭菌法。

高压蒸汽灭菌法适用于普通培养基、生理盐水、手术器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的灭菌。高压蒸汽灭猜改菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103－206kPa时，湿度可达121.3-132℃。

高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌，为目前可靠而有效的灭菌方法。适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等。

手提式高压蒸汽灭菌器：为金属圆筒，分为二层，隔层内盛水，有盖，可穗亩判以旋紧，加热后产生蒸汽。锅外有压力表，耐早当蒸汽压力升高时，温度也随之相应升高。该灭菌器体积小，可自发蒸汽，便于携带。

3. 培养基灭菌效果检验方法是什么

灭菌结束后，在锅内的不同位置，抽取若干支试管或料瓶(袋），贴上标签，置25℃-30°C下空白培养6天左右进行检查。如果所有试管或瓶（袋）培养基表面和内部均无任何变化，则表明已达到了灭菌的目的，可供接种使用；如果个别试管或瓶（袋）的培养基上出现有杂菌菌落，这就要作具体分析。可能是在摆放试管、瓶(袋）时，放得太紧，没有间隙，导致蒸气不畅通或灭菌锅的结构不太合理等原因所致，应根据具体情况进行改进；
如果是大部分或全部试管、瓶（袋）培养基上出现了杂菌菌落，基本上可判断是由于温度或灭菌时间不够，这就要提高灭菌压力或延长灭菌时间。 经多批次灭菌和检验后，培养基都能达到彻底灭菌的要求，则以后在采用同样培养基和同样灭菌方法时，可不必每批都进行检验。

4. 已经灭菌的培养基如何进行无菌检查

一般灭完菌后将培养基放在30-37度的环境中培养一天，看其有没有长菌（液体看是否变浑浊，固体看是否长菌落），即可知是否灭菌后为无菌。

培养基配制完毕后，应立即灭菌，通常在高压蒸汽灭菌锅内，汽相120℃条件下，灭菌20分钟。也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。

经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在4～5℃低温下保存要更好些。

(4)检测培养基灭菌效果的常用方法扩展阅读

培养基在使用前通过睁和高压或过滤灭菌，防止污染应该注意以下事项：

（1）确认工作细胞库是否被污染，确认毒种工作种子批是否被污染，确认所用培养基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染，均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。

同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱察睁内培养，48小时即可观察有无污染。

（2）其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果；前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作（至少应在除菌后进行一次）。

（3）另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞（尤其是细胞库）的污染。

5. 如何检验培养基灭菌是否彻底

将五组培养基放入28°的恒温培养箱中培养（放入培养箱主要为了防止被外界细菌污染，28°是大部分微生物的最适生长温度）。一般培养两天左右就可观察培养基结果，如果培养基中长出霉菌则待测样品被污染。

确认温度指示，传感器，温度记录仪的读数值：空载热分布测试时同时监测设备自身控制系统的温度显示示数和验证仪冷点温度探头显示示数，并记录3次。

(5)检测培养基灭菌效果的常用方法扩展阅读：

注意事项：

1、使用前应仔细阅读说明书，严格按要求操作。

2、先在高压蒸汽灭菌锅内加水，加水量应按照说明书上要求。

3、不可装太满，否则因压山毕烂力与温度不对应，造成灭菌不彻底。

4、记住达到所需压力的时间，通常灭菌要求1.1kgf/cm2,锅内达121℃，按不同灭菌要求维持压力15-40分钟。

5、不能随意延长灭菌时数锋间和增加压力。培养基要求比较严格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，琼脂在逗漏长时间灭菌后凝固力也会下降，以致不凝固。

6. 新配制的培养基如何灭菌如何检测效果

用高压蒸汽灭菌法灭菌，将灭菌后的培养基运改放入恒温培养箱中培养，观察是否漏悄铅有菌落产生，若没有，则证明培养基消毒返好完全

7. 如何检验灭菌后的培养基是否合格

把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取弊源数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明哪卜隐灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂李厅菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
经过几次检验都证明能彻底灭菌后,以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

8. 如何检验培养基灭菌是否彻底

将五组培养基放入28°的恒温培养箱中培养（放入培养箱主要为了防止被外界细菌污染，28°是大部分微生物的最适逗漏生长温度）。一般培养两天左右就可观察培养基结果，如果培数锋养基中长出霉菌则待测样品被污染。

确认温度指示，传感器，温度记录仪的读数值：空载热分布测试时同时监测设备自身控制系统的温度显示示数和验证仪冷点温度探头显示山毕烂示数，并记录3次。

(8)检测培养基灭菌效果的常用方法扩展阅读：

注意事项：

1、使用前应仔细阅读说明书，严格按要求操作。

2、先在高压蒸汽灭菌锅内加水，加水量应按照说明书上要求。

3、不可装太满，否则因压力与温度不对应，造成灭菌不彻底。

4、记住达到所需压力的时间，通常灭菌要求1.1kgf/cm2,锅内达121℃，按不同灭菌要求维持压力15-40分钟。

5、不能随意延长灭菌时间和增加压力。培养基要求比较严格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，琼脂在长时间灭菌后凝固力也会下降，以致不凝固。

9. 微生物检测中常用灭菌和消毒方法汇总......

消毒和灭菌两个词在实际使用中常被混用，其实它们的含义是有所不同的。消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。

利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。

a.灼烧灭菌法：

利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。

b.干热空气灭菌法：

这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160℃，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。

在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而，加速蛋白质变性而迅速死亡。

a.巴氏消毒法：

有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如，牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62℃，30分钟即可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。

b.煮沸消毒法：

直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

c.间歇灭菌法：

上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100℃，15～30分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37℃恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。

d.加压蒸汽灭菌法：

这是发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最常用的一种灭菌方法。它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。

加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121℃。在这种情况下，微生物（包括：芽孢）在15～20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的，如，灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。

在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。

a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在50～65℃，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121℃，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。

b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长。

c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。

a.pH值普遍下降。

b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。

例如，Ca2+与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。

c.不少培养基颜色加深。

d.体积和浓度有所变化。

e.营养成分有时受到破坏。

辐射

利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：

1）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。

2）应用β射线作食品表面杀菌，γ射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。

过滤

采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。

一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以，是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。

能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如，1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐剂没有选择性，因此，对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。

10. 在微生物的培养过程中,实验室对培养基灭菌常用的方法是________。为防止冷凝

（1）在微生物的培养过程中，实验室对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌．为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿倒置培养．
（2）接种时接种环需要灼烧灭菌；在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到单个菌落．每次划线之前及接种之后都要对接种环进行灭菌，因而划5个区域，则需要6次灼烧接种环．该培养基从物理状态上看，属于固体培养基．
（3）检测自来水中大肠杆菌的数量，可选用伊红美蓝培养基，伊红美蓝培养基除了为大肠杆菌的生长繁殖提供水和碳源外，还可以提供氮源和无机盐等基本营养成分．该研究小组在统计菌落数目时，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏菌落的数目，图中菌落分布不均匀，由此推测该同学接种时可能的操作失误是涂布不均匀．
故答案为：
（1）高压蒸汽灭菌 倒置
（2）6 固体
（3）氮源和无机盐 培养时间不足 涂布不均匀