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hcmv感染检测最敏感的方法

发布时间:2023-03-02 17:09:26

1. 巨细胞病毒抗体(CMV-IgG)和巨细胞病毒抗体IgM(CMV-IgM)的检测结果,望专业人士及团队能帮忙解答,谢谢!

表明没有感染病毒的IGM阴性,IgG阳性代表已经感染了艾滋病毒。因此,在怀孕前或怀孕期间,产科医生会要求做产前检查和产后护理检查,以确定是否正常的指标是看IGM是阴性或阳性。巨细胞病毒IGM是阴性,表明你是不是感染了这种病毒,所以对胎儿的影响不大。咨询产科医生和妇科医生的权威,她是这么说的,所以你可...以放心。通常只要提高个人体质,不要让病毒复发。所以,你可以考虑怀孕。 , IgM阳性,IgG抗体+:在体内抗体的早期感染;近期复发感染或潜伏在体内的病毒被激活,高风险,也可以采取其他检测方法进一步证实,如果近期感染指标仍积极或胎儿不佳,应终止妊娠。 IgM阳性,IgG抗体:原发感染的急性期,危险性极高,临床上非常罕见。该处理方法是相同的。 IgM抗体,IgG抗体+:早期感染,体内有抗体,有一定的免疫力,近期无感染。低风险,无需进一步处理。 IgM抗体,IgG抗体:没有感染史,对身体有没有抗体,没有免疫力。考虑无风险的易感人群,应严格监控,有条件的人工免疫。

2. 有关巨细胞病毒的治疗

孕产妇感染巨细胞病毒后的处理原则 : 1.妊娠早期确诊孕妇患巨细胞病毒感染,应立即行人工流产终止妊娠,或等待至妊娠20周时抽取羊水或脐静脉血检查特异性IgM,若为阳性应终止妊娠进行引产,以免分娩先天缺陷儿。2.妊娠晚期 感染巨细胞病毒或从宫颈管分离出病毒者无需特殊处理;妊娠足月临产后,可经阴道分娩,因胎儿可能已在宫内感染巨细胞病毒。由于新生儿尿液中可能有CMV,故应使用一次性尿布,或用过的尿布做消毒处理。3.产妇乳汁中检测出巨细胞病毒,应停止哺乳,改用人工喂养。4.抗病毒药物对巨细胞病毒感染孕妇无实际应用价值,阿糖腺苷8~l0mg/(kg·d)静脉滴注可能有效。大剂量干扰素能抑制病毒血症,缓解病情。概述编辑本段CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。 诊断编辑本段单靠临床表现不能诊断CMV感染,从临床标本中分离出病毒,同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高,将有助于诊断。 一、病毒分离 最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞,接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离,细胞病变效应(CPE)在1天或数周后出现,经固定和HE染色后可观察到巨细胞,核内有内包涵体,核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体,很象“猫头鹰眼”(owl′s eye)亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。 二、血清抗体检测 最常用的有补体结合试验(CF)、间接免疫荧光试验(IIF)、免疫酶试验(EIA)、间接血凝试验(IHA)和放射免疫试验(RIA)等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时,应当立即留血清标本,以及间隔2周、4周、8周再留血清标本,结合病毒分离可作原发感染诊断。 三、DNA探针 已广泛应用于检测CMV,其中以32P标记的探针敏感性最高,对某些标本来说,杂交方法可能比病毒分离更敏感。 四、聚合酶链式反应(PCR) (一)标本的采集及处理 采集的标本包括患者的血液、尿,以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层(buffy coats)可保存于-80℃;尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。 尿液标本经2500r/min离心10min,以除去细胞碎片,收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂,因此需用聚乙二醇(PEG6000)进行预处理:50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min;尽可能吸去上清,将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增;扩增时应于100℃加热10min,迅速置冰浴中冷却。 (二)模板DNA的制备 1.由血液标本制备模板DNA 方法A:向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L;取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。 方法B:由血沉棕黄层(BCP)制备: ① 用PBS洗涤BCP两次,收取沉淀。 ② 加入500μl 6mol/L盐酸胍,匀浆。 ③ 加入30μl 10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀,60℃反应1h。 ④ 加入1130μl 的乙醇,-20℃沉淀1~2h。 ⑤ 离心收集DNA沉淀。 ⑥ 用70%乙醇洗两次,最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA中。置4℃备用。 2.由冰冻组织标本制备模板DNA: ① 用恒冷切片机切取一块5~10μm冰冻组织块,置于1.5ml塑料管中。 ② 加入10%用缓冲液配制的福马林。 ③ 10min后离心1~2min轻轻倾去上清液,沉淀用乙醇洗2次。 ④ 于室温干燥10~60min。 ⑤ 加入抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使刚好浸没沉淀物(约50~100μl );将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。 ⑥ 37℃放置过液。 ⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。 ⑧ 离心收集上清,取1~10μl 即可进行PCR扩增。 3.由尿液标本制备模板DNA: ①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍,7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液(DNA PREP,Asahi Glass Co,Tokyo)混合。 ② 室温放置10min后,6400r/min离心2min,收集沉淀。 ③ 沉淀用50%乙醇,10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次,6400r/min离心1min。 ④ 同样洗涤沉淀2次,收集沉淀。 ⑤ 加入50μl 蒸馏水,于55℃作用15min。 ⑥ 15000r/min离心2min,收集上清(含HCMV DNA),进行PCR扩增,将此悬液于100℃加热10min,并迅速于冰浴中冷却。 (三)引物及探针 引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。 (四)PCR扩增步骤 1.10×反应缓冲液:100mmol/L Tris-HCl、pH8.4,500mmol/L KCl,25mmol/L MgCl2,2mg/ml明胶。 Taq DNA 聚合酶:5U/μl 。 10×dNTP:4种dNTP各2.0mmol/L。 引物:100pmol/L。 2.常规PCR扩增 10×反应混合物(50μl)反应缓冲液 5μl 10×dNTP 5μl 模板DNA 5μl Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU) 引物 各0.5μl 蒸馏水 3.8μl 加1~2滴矿物油。 将反应混合物于94℃加热5min;然后于95℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 60s,扩增35~40循环。 3.套式(nested)PCR扩增: ①反应混合物的组成同(2),仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3,共721b),各100pmol。于94℃ 60s,52℃150s,72℃ 480s,扩增20循环。 ② 取2μl 上述扩增产物,各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后,于94℃ 60s,52℃150s,72℃180s,扩增20循环。 (五)产物鉴定 扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。 1. 固相杂交: ① 预杂交液为3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30~60min。 ② 加入标记探针(10cpm/μg,2ng/ml),杂交30~60min。 ③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。 ④ 自显影。 2. 液相杂交及电泳分析: ① 取1/10体积的扩增产物与0.5~1.0pmol末端记的探针混合。 ② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl,10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液,使总体积为20μl 。 ③ 95℃ 10min,然后于56℃ 60min。 ④ 离心10s加入样品缓冲液,于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。 ⑤ 电泳毕,用溴化乙锭染色,然后对X线片曝光,自显影。 HCMV DNA分子很大,其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性,但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增,可鉴定90%的HCMV野型分离株;而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对,则可检测几乎所有的病毒株。因此,可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。 在HCMV模板DNA制备过程中,有时会产生一些小片段DNA,在PCR反应时常导致一定水平的本底产物,从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步:首先利用一对引物,扩增包括靶DNA在内的长片段DNA;然后取少量的扩增产物,利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数,即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。 PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物,可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平;利用该系统,在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出,较斑点印迹杂交提高2×103倍。 PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值,因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现,可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播,而且受感染的新生儿死亡率较高,因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施,对优生

3. 请学生物的同学帮忙介绍一下“PCR”

PCR
一、PCR概述
1、什么是PCR
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE(Perkin Elmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr. Mullis发明,由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。
2、PCR技术发展史
PCR原理是由一对引物介导,能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增,经过n个热循环扩增,扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0<E<1,扩增效率=倍,使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品:
 第一代:手动/机械手式水浴基因扩增
如上图所示,用三个恒温水浴箱,分别将三个水浴温度恒定在三个温度:PCR的高温变性温度(如94℃)低温复性温度(如58℃),适温延伸温度(如72℃)。再用一个装有PCR标本试管的提篮,用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴,标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环:
94℃ 30S 58℃ 45S 72℃ 60S
40次循环
这种方法的特点是:实验人员劳动强度大,容易因疲劳引起差错;而优点是:设备简单,投资少,与自动化基因扩增仪相比,它无须升降温过程,实验时间短,试验更接近理想PCR反应条件,事实表明实验效果还是不错的,但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中,因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰,影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶(某些PCR反应需要多于三个温阶)、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。
为改进提高本方法的自动化水平,有人设计了机械手装置,替代上述手工移动标本过程,形成了机械手水浴式基因扩增仪,该改进解决了实验人员的高强度劳动问题,但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪在九十年代中期我国北京、上海有定型的产品销售,应用也较广,曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献,而后便逐步被自动化程度更高的扩增仪替代,现在很少有单位使用。
 第二代:自动化控制型定性基因扩增仪
与上述水浴式扩增仪相比,也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪,它是最具代表性的扩增仪,包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。
 第三代:终点定量/半定量
第二代的定性PCR只能判断阴性阳性,而无法评价特定核酸的浓度及定量分析,定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能:
•潜伏期病毒浓度探测
•感染程度
•致病病原体数量变化测定
•抗病毒药物疗效评估
•恢复期病毒载量检测
自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来,PCR技术和应用从定性向定量快速发展.终点定量PCR的优点是设备投资少,对于国内经济条件还不能购买昂贵实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构,利用现有的第二代常规定性PCR仪,在添加一台专用的单孔PCR终点产物荧光定量检测仪便可开始工作,起到定量的作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品,而PCR终点产物荧光定量仪进口产品较少,国产仪器较多,如西安天隆的TL988,上海棱光的DA620型等
第四代:实时定量PCR
实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
见下图:(略)
2、实时荧光定量PCR的优势:
设备由荧光定量系统和计算机组成,用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平,这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值(限制点的循环数)。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大,这样可以获得最准确,可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品,线性回归分析将产生一条标准曲线,可以用来计算未知样品的浓度。
3、实时荧光定量PCR技术原理
所谓real-time Q-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期,Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 (baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义 样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。
4、实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用
⑴ 病原体检测:目前,采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
如:结核菌基因诊断的意义主要表现在:
a.区分TB与其它分枝杆菌;
b.检测TB耐药基因;
c.提高TB的阳性检出率。
⑵ 产前诊断:到目前为止,人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗,只能通过产前监测,减少病婴出生,以防止各类遗传性疾病的发生,如为减少X连锁遗传病患儿的出生,从孕妇的外周血中分离胎儿DNA,用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法,易为孕妇所接受。
⑶ 药物疗效考核:对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示:病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达,干扰素治疗作用不敏感,而HCV低滴度,干扰素作用敏感;在拉米夫定治疗过程中,HBV-DNA的血清含量曾有下降,随后若再度上升或超出以前水平,则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的应用及意义:
a.了解乙肝病毒在体内存在的数量。
b.是否复制。
c.是否传染,传染性有多强。
d.是否有必要服药。
e.肝功能异常改变是否由病毒引起。
f.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。
g.判断药物治疗的疗效。
⑷ 肿瘤基因检测:尽管肿瘤发病的机理尚未清楚,但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变,而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现,荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
(5)在优生优育中的应用:
近年来经济发展迅猛,人民生活水平逐年提高,对自身及家人特别是下一代的身体健康愈来愈重视。另外,由于国内计划生育工作逐步走向深化,独生子女比较多,孩子的身体素质更成为长辈们关注的焦点。因此,怎样提高新生儿质量改善人类遗传素质,即优生优育已显得非常重要。①避免有严重遗传性疾病和先天性疾病的个体出生。②增进体力、智力优秀个体的繁衍。其中避免有严重遗传性疾病及先天性疾病个体出生是优生优育最基本的内容。从临床优生学角度分析具体工作包括在母亲妊娠期间对母亲及胎儿进行遗传学检查尽量排除常见的遗传性疾病个体的出生,另外在妊娠期检查母亲是否患有某些易引起胎儿畸形的传染性疾病如弓型虫、风疹病毒、衣原体等感染。以往对遗传性疾病的检测主要使用染色体分析法,而临床绝大部分遗传性疾病是基因病而不是染色体病,染色体发析法不能检出的。若使用PCR基因扩增法联合单链构型多态性分析(sscp)、限制性片段长度多态性分析(RFCP)等位基因特异性寡核某酸(Aso)点杂交或差异PCR可以很方便地检出单个基因的突变而且其准确性可达95%以上,因此使这一问题得到了较好的解决。常见的易致胎儿畸形的感染性疾病原体主要有单疱病毒(HSVⅡ)、风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(HCMV)、弓形体(TOX)及沙眼衣原体(CT)。以往这些病原体感染诊断比较困难,主要靠培养法进行确诊,而培养法费时,代价昂贵,而且受到采样、样本保存及用药等因素的影响,基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪,是最值得推荐的检验方法。
1、PCR基因扩增法在遗传性疾病产前诊断中的应用,遗传病是由于遗传物变化而引起的机体某一功能或缺陷或异常所致的疾病,其根本变化在于遗传物质。其类型包括单基因遗传病,染色体遗传病及多基因遗传病。遗传病诊断除询问病史,一般物理诊断,普通实验室检查及了解症状、体征外有特殊性。过去常应用系谱分析,染色体及性染色色质检验作为遗传病诊断的主要依据,再辅以相关的酶学分析从而作出诊断。随着分子生物不的迅速发展及其在遗传性病诊断中的广泛应用,基因诊断技术诞生,基因诊断技术为遗传病的临床诊断起了很大的促进作用。聚合酶链反应(PCR)技术是基因诊断主要技术之一。这种快速、灵敏的基因体外扩增技术与多种分子生物学手段相配合可以检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等,PCR技术日益成为遗传病诊断的最有效、最可靠的方法之一。以下举几个在国内有普遍意义的例子。
(一)、PCR检测地中海贫血;地中海贫血(Thalassemia)是一种遗传性慢性溶血性贫血病,是世界上最常见且发病北最高的一种单基因遗传病。在两广、贵州、四川等地发病率较高,在广西等地高达15%。地中海贫血是由于基因突变造成珠蛋白的不平衡,使结构正常的肽链合成量减少甚至没有合成表现为溶血性贫血。接受累基因种类分为α、β、γ等,其中以 α、β地贫为最常见,危害了最大。珠蛋白基因簇位于人6号染色短臂上,有两个重复基因基因位于α1、α2、两个α基因及其旁侧序列有很大的同源性,易出现染色体不等交换,导致α基因缺失-α地贫。α地贫基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同时缺失及非缺失型地贫。可以应用PCR技术扩增α1、α2基因从而检测这些基因是否缺失、突变等,从而对α型地中海贫血作出诊断。β地中海贫血基因缺陷主要表现为基因序列中单一核苷酸的突变,或少数碱基的缺失、插入,使正常β珠蛋白肽链合成减注或缺失。应用位点特异性寡核苷探针(Aso)进行PCR产物斑点杂交即可对其作出诊断。
(二)、苯丙酮尿症,苯西酮尿证(PKU)是一种常染色体隐性遗传病,患者因苯丙酸羟化酶转化为酷氨酸,使苯氨酸及其代谢物在体内大量蓄积,出现脑组损伤及不可逆性智力发育障碍。PKU患者出生时正常,新生儿一经确诊为PKU停止母乳喂养采用低苯丙氨酸钦食疗法8—10年,可使患者智力水平发展维持正常。由于低苯丙氨酸钦食非常昂贵,一般家庭难以承受,因此,施行产前诊断,防止患儿出生是最好的选择。PAH只在肝细胞中表达,不能用血细胞,成纤维细胞、羊水、绒毛细胞进行酶活性分析,只能进行基因诊断。PKU的基因变化并非全部PAH基因的缺失,而是以点突变为主要表现形式,而且其突变位点很多。必须使用PCR扩增结合,ASO,SSCP或使用扩增片段长度多态性分析(AmpFLA)进行检测,这些技术都较复杂,检验人员须经专业培训。
(三)、血友病,血友病是一组最为常见的遗传性凝血障碍,根据因子缺陷的不同分为甲、乙两型,(Ⅷ、Ⅸ因子缺陷),也有复合型血友病,但不常见。甲型血友病发病率为1/10000,Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近,全长186Kb,大范围的基因重排(缺失、插入、重复)导致甲型血友病的病例很少,仅为Ⅷ因子缺陷的5%,大部分病人表现为单个或少数碱基的突变。由于Ⅷ因子基因长度为186Kb,突变位点多,而且新生突变频率高,从临床角度讲不能对每一个突变都检测,可对最为常见的几种突变类型进行检测,主要的检测手段是PCR结合RELP分析。乙型血友病发病率占血友病的20%,其基因变化及检测方法与甲型血友病类似。
(四)、性别发育异常,区别雄性及雌性的物质基础是性染色体,哺乳动物胚胎发育中,雌性表型不需要任何调节,而雄性表型则由多因素决定,位于Y染色体上的指导雄性性别分ss化的基因命名为睾丸决定因子(TDF)。现代研究表明,SRY(Sex-determining region of Y chromosome)基因是TDF基因,位于Y染以体短臂末端。SRY区缺失易导致46XY核型个体发育成女性。进行基因检测可以检出SRY基因组的易位及缺失,从而诊断性别发育异常,这一探索性别异常的研究非常热门。另外还有一种46XY核型异常的病人即睾丸女性化,这是用于雄激素受体(androgen receptor,AR)基因缺欠,使雄激素的靶基因对雄激素不应答就答或不全而引起的,根据病情的不同有不同的表型,AR缺陷有很高的新生突变频率,表现为无家族史的散发病。AR基因长90Kb,位于X染色体上,AR基因异常大部分为个别基因碱基的突变,可以通过PCR结合ASO或SSCP检出。
(五)、脆—X综合征,脆—X综合片(fragile-X Syndrome,Frax)是发病率最高的一种X-连锁的智力低下综合征(X-linked mental retardation XLMR)。因这种综合征与X染色体上的脆位点连锁而得名。大多数FRAX男性智商(IQ)低于50,并有随着年龄增长而下降的趋势。用人工酵母染色体(artificial yeast chromosome,YAC)克隆技术分离获得覆盖X-脆位点区域的YAC克隆,在这一克隆中获得一个能在人脑中表达的基因命名为FMR-1(fragile X mentai retardation-1),FMR-1的5‘端有一个CGG(精)三核苷酸串(CGG)n,正常人群中(CGG)n中存在多态性,重复序列为6-46个,当重复超过52个时,此区域的分裂呈不稳定,导致重复序列大幅度增加,无临床表现的携带者插入片段长度小于500bg,有临床表现者,长度都大于600BP而且伴有甲基化。人们将500bp作为前突变与全突变的分界线。对Frax的诊断以前用细胞遗传学的方法检测脆位点,实验条件严格,成功率不高。现在采用分子遗传学方法即可诊出前突变及全突变。用PCR扩增CGG重复序列,检测扩增产物的长度。突变基因的扩增片段增大,体细胞异质性时出现多条长度不等的扩增带甚至拖尾成一片,或者因为扩充的全突变插入片段过长超出PCR扩增能力而结果无扩增现象。
2、PCR基因扩增法在“Torsch”诊断中的应用,在妊娠早期(1-3个月),有些病原微生物的感染易导致胎儿畸形,这些病原体中最常见的有弓体(TOX)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)、沙眼衣原体(CT)、及巨细胞(HCMV),对这几种病原体的检测根据其英文词首简称为Torsch试验。
(一)、弓形体的PCR检测,弓形体有广泛的自然疫原性,人体多为隐性感染,抵抗力低时可以有临床表现。弓形体的诊断较困难,血清学方法敏感性较高但有交叉性出现假阳性而且无法确定近期感染、远期感染或一过性感染。确诊的方法是活组织检查或动物接各,这些方法阳性率太低不能推广。PCR检测可以检出样本中1-2个病原体而且准确性高,是目前对弓形体检测最优秀的方法。作为优生优育检查应于妊娠前或妊娠早期取全血样本,可以用EDTA或肝素抗凝,以EDTA抗凝效果最好,检测外周血白细胞中是否有TOX存在。对于不孕,多次自然流产或养小动物的产期妇女,作弓形虫检测有更重要的临床意义。
(二)、风疹病毒感染:风疹病毒(RV)是一种单股正极性RNA病毒,人是风诊病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎儿的畸形,影响胎儿免疫系统的发育,因此RV检测在优生优育工作中显得非常重要。RV检测可以用直接培养法及IgM抗体测试法。培养法费时很长而且常受到其它病毒的干扰,IgM测定法结果了不太准确,PCR法敏感性及特异性都很高而且简便快速,是RV感染最优秀的测试方法之一。风疹病毒侵入体内后在上呼吸道增殖而出现症状,面部出现丘疹,迅速遍及全身。样本采用妊娠母亲的咽部拭子、血清、产妇的绒毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒,PCR扩增较复杂,应注意样本的采集时机,操作的准确性。
(三)、单纯疱诊病毒,单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是一种DNA病毒,可引起多器官的炎症,可通过性接触传播。HSVⅡ感染复发率高,80%的感染者于12个月内复发。HSV感染后经机体免疫系统清除,少数病人终生携带,体弱时复发。PCR法检测HSV敏感性高而且可以直接对HSVⅠ/Ⅱ型进行分型鉴定。
(四)、沙眼衣原体,沙眼衣原体(CT)不仅能引起沙眼而且能引起生死器感染,是一种性传播性疾病。与淋病(NG),梅毒等经典性传播性疾病不同,CT易经其它接触途径传播,少数地区对妊娠期妇女普查结果表明此人群中发病率高达20%-30%。在欧美等国家CT的感染已超过淋病而居性传播性疾病之首。衣原体感染常呈无症性或非特异性症状的隐性感染,不容易诊断。以往用培养法进行确诊,费时且敏感性、准确性都不足。PCR用于CT检测时应注意不同检测目的的取材不同,对于性传播性疾病诊断应取生殖道分泌物(查脱落细胞),而对于早期妊娠病人应查其全血样本,在妊娠后期或临产时再查阴道分泌物以便指导生育时产道清理。
(五)、人巨细胞(HCMV),HCMV感染十分普遍,除少数原发性感染发生原发性单核细胞增多症外,极大多数为隐性感染。HCMV可以长期潜伏在体内,当机体免疫功能低下时,病毒会激活而造成严重疾病在妊娠期如果孕妇感染HCMV可以引起早产、畸形、死胎及新生儿巨细胞包涵体病等。HCMV属疱疹病毒科,可以从唾液、尿、宫颈分泌物及乳汁排出。HCMV“金标准”的诊断试验是用单层成纤维细胞作病毒培养,其它的实验检查有血清学的检测及包涵体检测。PCR是HCMV检测的一种新方法,用于检测的样本有血,生殖道分泌物拭子等,用于优生优育检测时应取血样本。对于早期妊娠病人若有HCMV感染应再检测羊水,或其它妊娠物,对病人认真及进跟踪检查,综合判断并采取相应的医疗措施。
PCR应用于优生优育有很大的优越性,使这一技术的推广应用刚刚起步,应注意操作的准确性,尽量避免误诊。对感染性疾病首先应取孕妇血样检测,有可疑时或血中检出病原体核酸时应尽早作羊水等妊娠物检查。不管是否怀疑胎儿有严重遗传病倾和中或有感染引起的畸形风险,对胎儿的去留应尊重胎儿父母亲的意见。
5、实时荧光定量PCR技术在研究方面的部分应用
一、 新药开发研究,人用药物及其他药物
针对一些感染性疾病的药物,如各种病毒病、细菌病等,在新药的开发过程中,快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金,与以前所用的Elisa等方法相比,实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,因此有利用分析药物的作用效果,为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。
此方法除了用于人用药物以外,还可以用于畜用药物,甚至其他经济动物及植物的药物研究等,因此其在药物研究方面的应用范围是很广的。
二、 超早期感染用药物及疗法的研究与开发
实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量,因此不必等到病人体内产生抗体,同时,由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语,在病毒感染的早期,即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域,即在病毒或细菌含量很低时如何用药,用什么药以及用药量等进行研究,为将疾病消灭在超早期作出贡献。
三、 药物疗效研究,人用药物及其他药物
对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药,其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究,为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量,灵敏度也不够,因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多,意义也很大。
四、 新的愈后指标的研究
对于感染性疾病,在药物作用至一定程度后,就认为可以停药了,但是应该在什么停药,现在大都没有一个明确的指标,现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制,这一指标未必合理,因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究,从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。
五、 新诊断及检验试剂的开发
现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等,而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点,从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂,从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等;这类试剂的种类是非常多的,所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。
六、 血液检验漏检率
由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多,因此,血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率,即分析Elisa方法测定为阴性的血样,再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时,一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。上海用此方法在用于血液制品的血液中发现一例HIV,后经测定供血者,证实病人的确是HIV阳性。北京市红十字血液中心正在测定北京血站中5万份Elisa阴性血样的漏检率。由于不同地区所用的Elisa试剂、方法、批号等都不相同,因此不同地区都有必要进行这一工作。
由于荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点,其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的,如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等;研究人员也可以根据自己研究项目开发其新的用途。
二、TL988实时荧光定量PCR检测系统产品介绍
1、如何选择一款适合自己的PCR仪
回顾分子生物学的发展历程,PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中,最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃,通过对PCR过程的实时监控,专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度,已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。我公司从荧光定量PCR的原理入手,详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术,为定量PCR仪的选择提供详细参考。
定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。从前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键--由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的,对于定量PCR系统来说,重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等,更重要的还在于样品孔之间的均一性,以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统,多色多通道检测是当今的主流趋势--仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品,通道越多,仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计,这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。--随着定量PCR技术在临床诊断、疾病

4. 感染巨细胞病毒表现是什么

巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)亦称细胞包涵体病毒,是一种疱疹病毒组DNA病毒。分布广泛,其他动物皆可遭受感染,引起以生殖泌尿系统,中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染,从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。 巨细胞病毒药品唾液、尿液、子宫颈分泌液等标本离心沉淀,将脱落细胞用姬姆萨...染色镜检,检查巨大细胞及核内和浆内嗜酸性包涵体,可作初步诊断。分离培养可将标本接种于人胚肺纤维母细胞中,由于CMV生长周期长,细胞病变出现慢,为了快速诊断,可将培养24小时的感染细胞固定,用DNA探针进行原位杂交,检测CMVDNA。用ELISA检测lgM抗体和lgG抗体,适用于早期感染和流行病学调查。IgG抗体可终身持续存在,lgM抗体与急性感染有关。不论是初次感染或复发感染,当病毒血症时,可用葡聚糖液提取外周血单个核细胞,制成涂片,加CMV单克隆抗体,采用免疫酶或荧光染色,检测细胞内抗原。 应用免疫印迹法和分子杂交技术直接从尿液,各种分泌物中检测CMV抗原和DNA是既迅速又敏感,准确的方法。CMV感染诊断中应注意的问题:CMV感染的诊断依据详见CMV感染诊断方案,临床应用中需注意以下几方面的问题。 1.对CMV感染的诊断主要依靠实验室检查结果,因此实验室操作从试剂选用至结果判定,都需保证质量。采用国际上尚未公认的新方法时,应与“金标准”病毒分离等结果对照,考核其可靠性。2.在中国小儿中,原发感染大多发生于婴幼儿时期,此时又多呈产毒型感染状态。以后随着年龄增长趋向潜伏感染。但在患有其他疾病时,体内病毒又可被激活,呈现产毒型感染。如人们观察过3岁以上的53例急性黄疸型甲型肝炎,在他们的急性期除2例(3.8%)外均伴有CMV感染,其中半数以上(64.2%)为再发感染,以后随访中发现又转为潜伏感染,可以作为佐证。 3.CMV感染小儿多表现为无症状性感染,只有少数为症状性感染,且又多发生于先天性和围生期感染患儿。在严重免疫缺陷时,可出现肺炎、肝炎等全身疾患。 4.CMV感染可累及宿主机体各个器官和系统,但产生严重病变的机会不多,靶器官的损害又与患儿的年龄有关。中枢神经系统损害(如小头畸形、智能障碍等)和先天畸形主要见于先天性感染;肝炎、肺炎还可见于婴幼儿时期感染。因此,在生后感染患儿身上发现有中枢神经损害和先天畸形,将其归为CMV感染所致是不科学的。 5.新生儿在娩出时,往往会在其体内混入微量母亲血液,脐带血更甚。故从脐带血或初生新生儿血中用PCR法查得CMVDNA,以示新生儿感染也是不可靠的。应该再次对新生儿复查或作其他病毒学检查核实。 6.对症状性CMV感染如肺炎、肝炎的诊断,仅仅依赖血清学或尿、血中病毒学检查阳性结果也欠妥当。因为这些检测结果只能表现体内有CMV存在或复制,却无定位意义。如从病变肺、肝组织中原位检测阳性则就可靠,但是实施困难。因此,应该采取肺炎患儿的下呼吸道分泌物替代或排除能够引起同样病症的其他病因和病原,力求诊断可靠。 建议您,到权威医院检查,及时治疗。

5. 婴儿感染巨细胞病毒的症状

巨细胞病毒 【巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)】:是一种疱疹病毒组DNA病毒。分布广泛,有与其他动物皆可遭受感染,引起以生殖泌尿系统,中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染,从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。 巨细胞病毒(Cytomegalovirus CMV)亦称细胞包涵体病...毒,由于感染的细胞肿大,并具有巨大的核内包涵体,故名。 一、生物学性状 CMV具有典型的疱疹病毒形态,其DNA结构也与HSV相似,但比HSV大5%。本病毒对宿主或培养细胞有高度的种特异性,人巨细胞病毒(HCMV)只能感染人,及在人纤维细胞中增殖。病毒在细胞培养中增殖缓慢,复制周期长,初次分离培养需30~40天才出现细胞病变,其特点是细胞肿大变园,核变大,核内出现周围绕有一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。 二、致病性 CMV在人群中感染非常广泛,我国成人感染率达95%以上,通常呈隐性感染,多数感染者无临床症状,但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺其他腺体,以及多核白细胞和淋巴细胞,可长期或间隙地自唾液、乳汗血液、尿液、精液、子宫分泌物多处排出病毒。通常口腔,生殖道,胎盘,输血或器官移植等多途径传播。 (一)先天性感染 妊娠母体CMV感染可通过胎盘侵袭胎儿引起先天性感染,少数造成早产、流产、死产或生后死亡。患儿可发生黄疸,肝脾肿大,血小板减少性紫斑及溶血性贫血。存活儿童常遗留永久必性智力低下,神经肌肉运动障碍,耳聋和脉络视网膜炎等。 (二)围产期感染 产妇泌尿道和宫颈排出CMV,则分娩时婴儿经产道可被感染,多数和症状轻微或无临床症状的亚临床床感染,有的有轻微呼吸道障碍或肝功能损伤。 (三)儿童及成人感染 通过吸乳、接吻、性接触、输血等感染、通常为亚临床型,有的也能导致嗜异性抗体阴性单核细胞增多症。由于妊娠,接受免疫抑制治疗,器官移植,肿瘤等因素激活潜伏在单核细胞、淋巴细胞中病毒,引起单核细胞增多症、肝炎、间质性肺炎、视网膜炎、脑炎等。 (四)细胞转化和可能致癌作用 经紫外线灭活的CMV可转化啮齿类动物胚胎纤椎母细胞。在某些肿瘤如宫颈癌、结肠癌、前列腺癌、Kaposis肉瘤中CMV DNA检出率高,CMV抗体滴度亦高于正常人,在上述肿瘤建立的细胞株中还发现病毒颗粒,提示CMV与其疱疹病毒一样,具有潜在致癌的可能性。 四、免疫性 机体的细胞免疫功能对CMV感染的发生和发展起重要作用,细胞免疫缺陷者,可导致严重的和长期的CMV感染,并使机体的细胞免疫进一步受到抑制,如杀伤性T细胞活力下降,NK细胞功能减低等。 机体原发感染CMV后能产生特异性抗体和杀伤性T淋巴细胞,激活NM细胞。抗体有限CMV复制能力,对相同毒株再感染有一定抵抗力,但不能抵抗内源性潜伏病毒的活化,及CMV其他不同毒株的外源性感染。而通过特异性杀性T淋巴细胞和抗体依赖细胞毒性细胞能发挥最大的抗病毒作用。 五、微生物学诊断 唾液、尿液、子宫颈分泌液等标本离心沉淀,将脱落细胞用姬姆萨染色镜检,检查巨大细胞及核内和浆内嗜酸性包涵体,可作初步诊断。 分离培养可将标本接种于人胚肺纤维母细胞中,由于CMV生长周期长,细胞病变出现慢,为了快速诊断,可将培养24小时的感染细胞固定,用DNA探针进行原位杂交,检测CMV DNA。 用ELISA检测lgM抗体和lgG抗体,适用于早期感染和流行病学调查。LgG抗体可终身持续存在,lgM抗体与急性感染有关。 不论是初次感染或复发感染,当病毒血症时,可用葡聚糖液提取外周血单个核细胞,制成涂片,加CMV单克隆抗体,采用免疫酶或荧光染色,检测细胞内抗原。 近年应用免疫印迹法和分子杂交技术直接从尿液,各种分泌物中检测CMV抗原和DNA是既迅速又敏感,准确的方法。 六、防治原则 丙氧鸟苷(ganciclovir DHPG)有防止CMV扩散作用。如与高滴度抗CMV免疫球蛋白合用,可降低骨髓移植的CMV肺炎并发症死亡率,如果耐丙氧鸟苷的CMV感染可选用磷甲酸钠,虽能持久地减少CMV扩散,但效果比前者差。国外研制CMV病毒活疫苗,能诱导产生抗体,但排除疫苗的致癌潜能,有待解决

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