转录因子erg检测方法

1. 氧化应激指标的常用检测方法

氧化应激的定量评价方法大致分做三类：

1）测定由活性氧修饰的化合物；

2）测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量；

3）测定含有转录因子的氧化应激指示物。

进一步尚有：

1）生物体内氧化应激的程度足以产生应答；

2）活体内难以蓄积；

3）在活体内不是被代谢，而是稳定存在，等等。理解这些要点对于临床普及推广都很有用。

但在临床上，氧化应激的定量仍旧存在问题。因氧化应激与各种各样疾病均密切相关，故缺乏特异性，其量化指标难以用于特别指定的疾病。所以目前认为，当用于“全身评价”，或者在已经明确疾病原因为氧化应激后的“严重程度及予后”的评价。

(1)转录因子erg检测方法扩展阅读

抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于许多自由基引起的及老化相关疾病都能够预防。例如常见的糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆等疾病都被认为与自由基相关。

抗氧化剂能在自然饮食中找到，是被称为三大抗氧化物质的维生素E、维生素C、和β-胡萝卜素。他们可以利用自身结构的特性来稳定自由基多余的电子，防止对细胞造成老化。豆类富含大量的膳食纤维和抗氧化剂，其中红豆和黑豆抗氧化剂最多。苹果中含有多种基本维生素和强抗氧化剂。

2. 转录因子的研究思路

转录因子（Transcriptionfactor，TF)是一种能与特异DNA序列结合的蛋白，可以单独或与其他蛋白形成复合体，提高或阻断特定基因对RNA聚合酶的招募，调控基因的表达。转录因子的特点是它包含一个或多个DNA结合域（DNA-binding domain，DBDs），通过这些结合域与基因附近的DNA序列结合，从而完成调控。下面结合文章介绍转录因子的研究方法。

01   案例文章简介

案例文章 ：

Ahr-Foxp3-RORt axis controls gut homing of CD4+T cells by regulating GPR15. Sci Immunol. 2020, 5(48). （IF=13.44）

GPR15是一种趋化因子受体，在T细胞向大肠归巢的过程中发挥重要作用。这项研究发现小鼠大肠Treg中的GPR15表达水平最高，芳香烃受体（Ahr）可通过增加GPR15的表达促进Treg向大肠的归巢，而Foxp3及RORγt在Ahr介导的GPR15表达上调中分别起到正向及负向调控作用。另外，在人结肠Treg中也可重复上述发现。该研究提示，Ahr-Foxp3-RORγt轴可通过调控GPR15的表达调节Treg的肠道归巢，从而影响肠道免疫稳态。

02   案例文章的研究内容

GPR15在小鼠大肠Treg中表达量最高，并且受Ahr控制。GPR15是一种孤儿鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）偶联趋化剂受体（GPCR），最初是基于其与其它GPCR家族成员的相似性而被发现的，也被称为HIV或猿猴免疫缺陷病毒共受体。最近有研究表明，GPR15对小鼠和人的调节性T细胞（Treg）和效应T细胞（Teff）的肠道归巢至关重要。芳香烃受体（Ahr）是一种环境传感器，可检测外源性配体，如环境毒素（如二恶英），以及宿主细胞、微生物群和饮食（如色氨酸代谢物）产生的内源性配体。通过流式细胞术检测GPR15蛋白在各种T细胞中的表达水平，发现Treg中GPR15的表达水平最高。在Ahr缺陷小鼠的CD4+ T细胞中，GPR15的表达水平降低。而在在Ahr过量表达小鼠的CD4+ T细胞中，GPR15的表达水平升高。

Ahr通过直接与Gpr15基因座结合调节GPR15表达。利用ChIP-seq在iTreg 和TH17细胞中发现Gpr15基因是Ahr最重要的全基因组靶点之一。Ahr在Gpr15基因座具有两个实质性的结合峰（在距转录起始点+15和+17 kb处）。

Foxp3与Ahr协同作用，正调节GPR15的表达。在CD4+ T 细胞中用shRNA干扰Foxp3，GPR15的表达水平降低。在来自Ahr+/+小鼠的iTregs细胞中强制表达Foxp3可显着提高其GPR15的表达，在来自Ahr-/-（Ahr缺陷）小鼠的iTregs细胞中却没有这种效果。在TH0条件下培养的分选CD4+T细胞中同时表达Ahr和WT Foxp3或Foxp3△FKH可以增加GPR15的表达，而Foxp3单独表达并不影响GPR15的表达。ChIP-qPCR表明Foxp3在Gpr15基因座的结合位点与Ahr相同（距转录起始点+15和+17 kb处）。Ahr缺陷不影响Foxp3在Gpr15位点的结合，但是在iTreg中敲低Foxp3后，Ahr向Gpr15基因座的招募减少。

RORγt负向调节GPR15表达。在RORγt缺陷Treg中，GPR15的表达增加。RORγt和GPR15表达的负相关系在Ahr充足和Ahr缺陷Treg中都很明显。此外，与来自RORγt充足的CD4+ T细胞分化的iTregs和TH17细胞相比，来自RORγt缺陷的CD4+ T细胞具有更高的GPR15表达。

RORγt拮抗Ahr在Gpr15基因座的DNA结合。在从RORγt缺陷小鼠分化的iTregs或TH17细胞中，Gpr15基因座的Ahr募集显着增强，而在没有Ahr的情况下，Gpr15基因座的RORγt结合显着增加，提示Ahr和RORγt与Gpr15基因座结合存在竞争。此外在RORγt缺陷iTregs中表达RORγt抑制GPR15表达。

Ahr通过调节GPR15促进Tregs向肠道归巢。在大肠（LI）和小肠（SI）中，归巢的Ahr缺陷iTreg相对于WT对照组减少了大约三倍。GPR15的强制表达显着增强了Ahr缺陷Treg向LI的归巢，但不增强到包括SI在内的其他器官的归巢，这与GPR15在Treg大肠归巢中的关键作用一致。此外， 在LI中WT-iTreg和GPR15恢复表达的Ahr缺陷iTreg的归巢能力相当（而不是在SI中），这表明GPR15在Ahr缺陷iTregs中的表达受损是其向LI归巢缺陷主要机制。在Ahr缺陷的iTregs中强制表达GPR15促进其在炎症期间归巢至LI。此外，强制表达GPR15的Ahr缺陷iTreg的过继性转移显着抑制了肠道炎症，表现为减轻了肠道组织学变化和降低了促炎细胞因子（即Tnf和Il1b）的表达。

Ahr信号促进GPR15在人Treg中表达。与之前的报告显示GPR15在人类Treg中的低表达不同，本研究检测到GPR15在所有患者样本中的表达。与外周血单个核细胞（PBMCs）相比，结肠Treg的 GPR15表达显着增高。人Treg中Ahr mRNA表达的增加与Gpr15表达的增加以及其他Ahr靶基因（Cyp1a1和Ahrr）的表达增加有关，这与Ahr促进Gpr15表达的作用相一致。此外，通过蛋白质染色分析GPR15和Foxp3的表达，发现Foxp3的表达与人CD127-CD25+ T细胞中GPR15的表达呈正相关。加入Ahr的配体FICZ显着增强了iTreg中GPR15和其他Ahr靶基因的表达，但不增强Ahr的表达，而用一种特异性Ahr拮抗剂CH223191治疗可消除人iTregs中GPR15的表达。

03   转录因子研究的技术手段

❶  双荧光素酶实验

某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现非共价结合，从而对基因的表达起增强或抑制的作用。双萤光素酶报告实验（al luciferase assay）是检测转录因子和靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，通过检测转录因子表达水平的改变对荧光素酶基因表达水平的影响，分析转录因子能否作用于启动子。

其原理简述如下 ：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到萤光素酶编码序列上游的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子的表达质粒、干扰质粒或者siRNA与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。通常会用另一种萤光素酶作为内参，避免转染效率对实验结果的影响。

（3） 加入特定的萤光素酶底物，萤光素酶与底物反应，发光，通过检测发光强度可以测定萤光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与靶启动子片段有作用。

❷  染色质免疫共沉淀

染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)被广泛用于研究体内转录因子与靶基因启动子上特异性核苷酸序列的结合，并已成为研究染色质水平基因表达调控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段。通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的DNA信息。ChIP-PCR用于鉴定转录因子结合到靶基因的启动子上，而ChIP-seq用于筛选转录因子直接结合的靶基因，探究转录因子的作用元件。

❸  电泳迁移率改变试验

电泳迁移率改变试验 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA ) 也称凝胶阻滞试验，DNA 在凝胶中的迁移率与相对分子质量及构型有关。裸露DNA与含有结合蛋白的DNA- 蛋白质复合物电泳时，裸露 DNA 迁移率主要取决于DNA本身，DNA-蛋白质复合物由于体积较大而滞留在较后位置。电泳迁移率改变试验用于体外分析转录因子与靶基因启动子的结合。将一系列序列不同的DNA片段与转录因子进行电泳迁移率改变试验，可以探究转录因子的体外结合序列。

3. 鉴定转录因子与启动子结合的方法和原理

一般有体外和体内两种较为常用的方法：
体外：用EMSA
通常将纯化的蛋白和32P同位素标记的DNA探针（取promoter部分）一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针.DNA-复合物比非结合的探针移动得慢.然后再放射自显影的仪器上就可以看到条带,如果条带移动得慢,就是有结合.
体内：报告基因方法
就是将你想要检测的promoter装在一个载体上,然后导入特定的细胞内.该细胞内有表达或者过表达你所想检测的转录因子.如果转录因子可以结合在你的promoter上,就可以启动下游的报告基因表达.报告基因可以是荧光蛋白,也可以是荧光素酶.
注：promoter--启动子.其实enhancer也可以用来当promoter.

4. 如何检测转录因子与启动子的结合能力

查询某一基因的启动子区有无某转录因子的结合位点可尝试用缺失分析，应先用Matinspector 预测有无转录因子结合位点的存在，然后将启动子区域克隆，构建一系列区域突变克隆，与基因编码转录因子的基因共表达，检测报告基因的表达，来判断转录因子同一个基因的启动子都是可长可短的，只是不同长度可能启动子的活性不一样。真核生物一般都是认为在第一外显子上游的2kb以内（也有2kb以外的）。转录因子不同的预测方法（除了PROMO，还可用Jaspar 、TFSEARCH、TRANSFAC等数据库）结果都不一样，最终只有实验验证的才准确。

5. 如何确定某个基因是否为转录因子

如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，从而对基因的表达起抑制或增强的作用，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，荧光素酶与底物反应，如pGL3-basic等。（3） 加入特定的荧光素酶底物转录因子是一种具有特殊结构，也称为反式作用因子。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，这些特异性的序列被称为顺式作用元件、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合。其原理简述如下，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比，产生荧光

6. 转录因子实验研究方法有哪些

1.什么是转录因子

转录因子（Transcription factor，TF）的调控决定着基因的调控网络以及表达水平。基因的表达驱动着一系列的细胞活动，这些表达的调控需要通过转录因子（蛋白）和转录因子结合位点（DNA元件）的相互作用实现。转录水平的调控不是一个简单的独立过程，它是由上百个转录因子，目标序列以及共调控因子所组成的高度互作的基因调控网络。

2.为什么研究转录因子

一个课题最开始往往是研究某个基因的序列信息以及基因所行驶的功能作用，这些是属于基因的下游研究。但在下游研究累积到一定经验之后，老师往往开始着手于研究基因的上游调控机理，即不单关注基因A如何影响细胞活动，更关注哪些因素影响基因A的功能发挥。调控机理研究理论上会涉及多个层面的因素，例如：转录因子、蛋白激酶、miRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰、lncRNA……

转录因子成为调控机理的研究大户是最正常不过的事情。因为一个转录因子能同时控制多个基因的表达，同时转录因子的功能作用也可能受多个共作用因子的影响。如果能阐明如此复杂的调控网络，这可是很有科研成就感的。

3.研究方法

现有主流的转录因子鉴别方法可分为两种：传统实验鉴别（experimental methods）以及通过计算机进行的生物信息学鉴别（computational methods）。简单来说，实验方法主要用于寻找不同类型目标，即通过已知TF寻找未知TFBS，或通过已知TFBS找出其对应TF。而生物信息学方法更多是用于同类型的预测，即通过序列保守性分析，通过已知TF预测未知TF，或通过已知TFBS预测未知TFBS。这些研究思路的关系如图1.

图1. 转录因子研究方式

3.1生物信息学预测（computational methods）

无论是TF还是TFBS的同类预测，生物信息的研究手段主要依赖于蛋白质或者DNA的序列保守性进行。具体算法和软件有隐马尔可夫模型,Gibbs抽样,贪婪算法等，但这次重点在于介绍研究转录因子的实验方法，因此不过于叙述这部分信息。

3.2实验方法筛选（experimentalmethods）

实验方法主要有两种思路：1. 通过已知TF寻找未知TFBS；2.通过已知TFBS寻找未知TF。无论哪种手段，前提都是基于蛋白与DNA之间的结合关系寻找，即交叉寻找目标，这有别于计算机技术的同类型寻找。

3.2.1通过已知TF寻找未知TFBS

如果已经锁定了一个感兴趣的TF，那常用思路是确定其TFBS，然后得知道它控制的下游基因。从已知TF定位到未知TFBS的过程，主要的实验方法包括ChIP-seq、DNaseI-seq、DamID-seq等体内实验，以及DIP-seq、SELEX(-seq)、PBM等体外实验。

这些研究的通量与应用范围如图2所示，其中，纵坐标表示可以从多大范围检测TFBS（检测通量），横坐标表示TF-TFBS的结合细节（检测精细程度）。以ChIP-seq为例，它可以在全基因组水平一次发现超过20万个结合位点信息，但只能确定到TFBS的序列信息（是ATTCG还是ACTCG），却难以了解到目标TF与TFBS之间的结合程度（TFBS能与TF结合多久，结合多牢固等信息）。

图2.多种转录因子研究方法的比较。 （CS：ConsensusSite，PWM: Position WeightMatrices）

3.2.1.1SELEX技术

Systematicevolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 是其中最早的一种体外检测转录因子结合位点技术，这项技术在20多年前已被科学家们利用，而且它不需要已知序列信息就可以检测到新的结合位点。它的原理是（图3a)：1.提取并纯化转录因子；2.随机打断的DNA文库与目标转录因子孵育；3.提取与TF结合的DNA，进一步PCR扩增片段；4.把PCR扩增的片段重复与TF孵育，最终筛选出高结合率的DNA。SELEX技术不需要已知的DNA片段信息就可以检测新TFBS，但不足之处在于它只能找出结合率高的TFBS，因此鉴定效率较低。

为了解决鉴定效率较低的问题，高通量测序技术可以联合SELEX筛选TFBS。关联高通量技术后，SELEX-seq只需要一轮筛选而不像之前需要多轮筛选，但它的问题在需要大量的高质量纯化蛋白以及前期实验操作复杂。

3.2.1.2Protein-binding Microarrays （PBM）技术

PBM技术（图3b）首先固定双链dna列阵在芯片当中，然后加入感兴趣的目标蛋白，孵育洗脱非结合蛋白后，加入带有荧光标记的抗体靶向目标蛋白，最后通过荧光信号鉴别蛋白-DNA结合关系。荧光强度会最终换算为PositionWeight Matrices（PWM），从而计算DNA的结合序列。

3.2.1.3DIP-seq

DIP-seq（图3c）是另外一种体外检测转录因子与dna关系的技术。与PBM不同，这种技术不需要预先固定DNA，它是通过检测染色质DNA来实现目标鉴定。大体的实验流程可分为：1.利用甲醛交联转录因子与DNA片段；2.切断DNA为100到500bp的片段；3.通过转录因子特异性抗体，富集与TF结合的DNA；4.去交联后，富集DNA进行芯片或高通量测序。

3.2.1.4ChIP-seq

ChIP-seq的实验过程与之间介绍的DIP-seq非常类似，唯一不同是，ChIP-seq可以通过甲醛原位交联TF与DNA，而DIP-seq只能在体外交联。ChIP-seq的优点是更高的分辨率，更低的噪音等。但它的弊端在于1.过于依赖蛋白数量，2.依赖于交联效率，3.抗体特异性及获取可能性。4.难以分辨直接结合还是间接结合的TF。

图3. 多种主流TF鉴定技术的操作流程

3.2.1.5.mechanically inced trapping of molecular interactions（****MITOMI）

MITOMI是少数可以测量TF与DNA解离系数Kd的实验技术，它具有中等通量，但却不适合用于de novo的TFBS鉴定。MITOMI具体流程图4：

1.将感兴趣的tf固定在玻璃上，接通微流管，倒入DNA；

2.DNA结合到固定的tf上；

3.富集结合的DNA，并洗脱未结合的片段；

4.通过富集的DNA数量计算蛋白-DNA解离系数Kd。

图4. MITOMI原理示意图

3.2.2.通过已知TFBS寻找未知****TF

比较常见的实验研究方法是酵母单杂交（Yeast one Hybrid，Y1H）及被称为反向ChIP实验 的PICh（Proteomicsof Isolated Chromatin segments）。

3.2.2.1酵母单杂交 （Y1H）

酵母单杂交能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。

主要实验过程为：

1.把感兴趣的TFBS序列（Bait）插入报告基因上游，并将带有TFBS与报告基因的质粒整合到酵母基因组中，构建含有报告基因的酵母；

2.提取mRNA构建转录因子cDNA文库，并将文库与酵母激活因子融合相连，构建“Prey”文库。把带有文库的质粒转入到步骤1的酵母中。

3.条件筛选生长酵母，如果TF与TFBS有结合，即报告基因可以顺利表达。

图5.酵母单杂交技术原理

3.2.2.2PICh实验

PICh，又被称为反向ChIP实验，实际是通过分离的感兴趣DNA片段富集转录因子，最终利用质谱技术鉴定所富集的蛋白质。PICh所分离的TF难以被识别为直接还是间接结合因子，同时，现阶段来说，这项技术的通量相对较低，不适合大批量筛选TF。

注意事项

1.体外实验虽然可以鉴别很多蛋白-DNA相互作用，但由于生物体复杂性（共调控因子，竞争性转录因子等），这些体外识别的相互作用难以在体内重复或发现。

2.体内实验比较真实地还原转录因子-DNA之间的作用，却难以鉴别出直接还是间接作用关系。

3.利用PBM方法可以完成de novo TFBS鉴别。

4.检测通量一般受限于蛋白质的纯化质量及数量。

5.大多数方法难以分析解离系数，因此对DNA或蛋白质的洗脱难以把握。

6.除了实验方法，通过计算机技术鉴别结合位点的保守性从而预测新的转录因子目标区域已经被大量使用。但无论何种算法，这些预测都过于简单化TF-DNA之间的作用关系，从而造成极高的预测假阳性率。

7.(i)ChIP, HT-SELEX, 或PBM方法的目的在于发现结合序列或PWM。 (ii) MITOMI分析可用于进一步分析定量信息。(iii) ChIP实验可用于分析体内结合信息。

附录

多种体内外TF鉴定方法的对比：

method：方法；

synomyms：实验名称；

throughput：检测通量；

materialsneeds：所需实验材料，其中P代表protein，D代表DNA，“＋”到“＋＋＋＋”分别代表数据可用于定性，半定量，定量及动力学分析；

Datatype：实验所产生的数据类型；

resolution：分辨率（可检测碱基程度）。

7. 如何预测转录因子结合调控的靶基因

如何预测转录因子结合调控的靶基因
简单的说法就是蛋白质和核酸结合的检测方法，一般来说，在基因表达调控中，参与调控的转长沪拜疚之狡瓣挟抱锚录因子是各种蛋白质，因此研究转录因子的一个主要内容就是研究蛋白质与DNA之间的相互作用。主要的检测方法有：
电泳迁移率改变分析
足迹法
染色质免疫沉淀
染色质免疫沉淀一DNA基因芯片
生物信息学方法
荧光素酶报告系统
基因表达谱芯片，经qPCR 和Western进一步验证。
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