检测质粒载体在细胞表达的方法

A. 质粒载体的四个基本特征

一、质粒载体的四个基本特征

1、质粒载体具有独立复制的能力。

2、质粒载体具有选择标记。

3、质粒载体具有独特的酶切位点。

4、质粒载体能够转化但是不扩散。

二、质粒的结构及性质

质粒是细菌染色体外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。

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质粒载体的使用：

1、基因过表达

一般是将目的片段整合到病毒或者质粒载体上，在目的基因上游加入调控元件，转染到宿主细胞中表达，使基因在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达，可以获取大量的目的基因产物，一般是蛋白质，用于研究或生产。

2、用作报告基因

质粒载体广泛应用于转录调控研究领域，包括启动子活性分析、miRNA与靶标鉴定、转录调控因子鉴定及转录调控因子结合位点等实验，将转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染到宿主细胞，通过检测报告基因产物表达量，判断启动子和转录因子的结合情况。

B. 导入真核生物细胞内的质粒如何表达

导入真核的质粒表达方式有两种，一种是瞬时表达。这种瞬时表达是由一些强启动子控制，使目的基因在真核细胞内瞬时强行表达，表达的过程无非还是转录翻译。不过这种以环形质粒导入细胞的瞬时转染质粒很容易在复制时丢失，所以叫瞬时转染。另一种叫稳定表达，这种一般是腺病毒载体或其他稳定转染载体，他们是以线性方式整合到真核细胞基因当中，和真核基因一样的表达，并拥有自己的启动子，这种表达方式比较温和，也会随真核细胞的分裂而遗传，所以叫稳定转染。

C. 列举3种研究基因在体内表达方式的试验方法

目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb/c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶(luc+)蛋白的重组质粒(pGL-3-CMV)或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部(2μg质粒DNA/4.5Mpa/枪)。于质粒注入后24~144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法

D. 检测受体细胞中的目的基因是否表达的方法是什么

首先要确认目的基因已经传入受体细胞。然后再检测其表达情况，一般有两种方法：一个是通过特定性状来判断目的基因是否表达，比如导入的目的基因是编码某种酶的，那么最简便有效的方法就是经过表达后检测有没有相应酶的活力，同时跑蛋白胶，看有没有预期的目的条带，因为对于酶来说，有时候目的基因虽然表达了，但是酶没有活力，这时就不是表达的问题了。另外一个就是利用抗原-抗体特异性结合原理，检测目的基因是否翻译成蛋白。