非洲猪瘟病毒鉴别国标方法

A. DG55155Tl设置方法

团体标准T/CVMA 5—2018
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法
Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus
中国兽医协会发布
前言
本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国兽医协会提出并归口。
本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。
本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。
1、范围
本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。
本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
2、规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3、试剂
3.1 DNA提取试剂
DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。
3.2 2 × PCR缓冲液
2 × PCR缓冲液的配制见附录A。
3.3 引物探针
3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：
上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'
下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'
荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB--3'
3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：
上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'
下游引物ASF-OIE-rPCRR：
5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'
荧光探针ASF-OIE-Probe：
5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'
3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。
3.4 阴性及阳性对照
阴性及阳性对照的制备方法见附录C。
3.5 其他试剂
消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。
消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。
4、仪器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。
5、操作步骤
5.1 样品采集及运输
样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。
5.2 样品处理
检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。
5.3 样品保存
采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
5.4 病毒DNA提取
5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。
5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。
5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。
5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。
5.5 实时荧光PCR操作
5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。
5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。
5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。
6、结果判定
6.1 结果分析条件设定
实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。
6.2 结果描述及判定
当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。
7、实验室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。
7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。
一
附录 A (规范性附录) 试剂的配制
A.1 DNA提取液1
PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。
A.2 DNA提取液2
1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。
即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。
A.3 2×PCR缓冲液
灭菌去离子水 70 mL
三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g
氯化钾 1.865 g
曲拉通X-100 0.5 mL
dATP (100mmol/L) 2.5 mL
dTTP (100mmol/L) 2.5 mL
dGTP (100mmol/L) 2.5 mL
dCTP (100mmol/L) 2.5 mL
六水氯化镁 0.61 g
盐酸 调pH至9.0
灭菌去离子水 加至100 mL
A.4 消毒液
8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。
A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方
A.5.1 A液
0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。
A.5.2 B液
0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。
A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。
A.6 无DNA酶的灭菌去离子水
无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。
二
附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列
1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT
三
附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照
C.1阳性对照
阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。
C.2 阴性对照
阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。
四
附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方
实时荧光PCR反应液配方见表D.1。
表D.1 实时荧光PCR反应液配方
组 分
1个检测体系的加入量
2×PCR 缓冲液a
12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）
1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）
1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）
1.0μL
探针（10 μmol/L）
1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）
0.5μL
去离子水
3μL
总体积
20μL
2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。
Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。
五
附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考
图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。
图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图
(资料来源：中国兽医协会）

B. 非洲猪瘟最简单的辨认方法，是如何传播的

1、病猪的体温上升到40-42℃，皮肤发红，结膜潮红充血，体表出血，精神萎靡，尤其是下腹、四肢等部位的症状较严重。2、病猪开始喘气咳嗽，呼吸困难，淋巴结、胃肠粘膜出血，同时伴有呕吐、食欲下降甚至废绝的现象，排出的粪便较干硬。3、母猪染病后会出现不孕、流产、死胎等情况，剖检死亡的病猪时可发现肺脏、肝脏、脾脏等脏器和淋巴结严重肿大。

一、非洲猪瘟最简单的辨认方法

1、病猪开始发热，体温达到40-42℃，皮肤发红，结膜潮红、充血，体表出血、瘀血，精神萎靡。病猪的下腹、四肢、臀部等部位的症状尤其严重。

2、病猪开始喘气、咳嗽、呼吸困难，淋巴结、胃肠粘膜、肾出血。病猪出现呕吐情况，食欲下降甚至废绝，粪便干硬，或出现便秘、排脓性血粪便的情况。病猪的眼睛、鼻子会有浆液性、粘液性物质流出。

3、母猪染病时，会出现不孕、流产甚至死胎等情况。病猪死亡后，剖检时可发现肺脏、肝脏、脾脏等脏器和淋巴结严重肿大，且一般有出血、瘀血等情况。

4、急性发病时，此疾病的死亡率比较高，尤其是母猪、大猪会快速死亡。

二、非洲猪瘟是如何传播的

1、传播方法

（1）体液传播

非洲猪瘟病毒可通过猪肉制品、猪的血液与精液进行传播，而且可以在这些物质中长时间保持活性。

（2）虫媒传播

非洲猪瘟病毒可以通过螯蝇、蜱虫、蚊子、牤等昆虫进行传播，并长时间保持活性。

（3）其他方式

非洲猪瘟病毒污染饲料、水源以及器具后，可通过这些媒介进行传播，污染农场附近的空气、猪场的工作人员及其服装也是潜在的传染源。

2、防控方法

（1）消灭养殖场里面的昆虫，防止传播病毒。

（2）投喂健康、安全的饲料，不可饲喂泔水。

（3）按时给猪群打疫苗，如果猪场内有部分猪只因不明原因而死亡，需报告有关部门。

（4）避免让外来人员、车辆进入养殖场，养殖场里面的饲料及用具需及时消毒。一旦爆发病情，应及时封闭养殖场。

C. 非洲猪瘟野毒与疫苗毒的区分，猪瘟特效药

非洲猪瘟野毒与疫苗毒一般需检测3个基因来区分，用CD2v基因或MGF360基因或两个全做来检测，野毒三个基因都为阳性，疫苗毒CD2v/MGF360为阴性。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒所引起的疾病，病猪会有发烧、食欲减退、无精神、呼吸困难等症状，在耳朵、鼻子等部位也会有紫斑。

一、非洲猪瘟野毒与疫苗毒的区分

1、区分方法

一般可检测3个基因来区分非洲猪瘟野毒与疫苗毒，用p72基因检测非洲猪瘟病毒后，再用CD2v基因或MGF360基因或两个全做检测感染的是野毒还是疫苗，野毒三个基因都为阳性，疫苗毒的CD2v/MGF360为阴性。

2、非洲猪瘟简介

（1）非洲猪瘟是我国重点防范的一类动物疫情，其发病过程短，最急性以及急性感染死亡率高达100%，是由非洲猪瘟病毒所引起的疾病。

（2）该病主要危害猪的脾脏、淋巴结、肾脏、肝脏、心脏等部位，病猪的体温会出现升高至41-42℃，食欲明显减退，没有精神，还会出现呼吸困难的症状，同时在耳朵、鼻子、腿部、腹部以及腋下等部位会出现明显的紫色斑。

（3）一般病猪在发热后第七天死亡，或症状出现1-2天后就会死亡。

二、猪瘟特效药

1、治疗猪瘟的特效药

治疗猪瘟一般没有特效药，平时多以预防为主，通常可注射猪瘟弱毒疫苗进行预防。猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，该传染性大，发病率和死亡率均高。

2、预防猪瘟的方法

（1）实行自繁自养，如果需要从外地购买猪种，运回后需隔离饲养半个月左右，确定无病且注射了疫苗，才能混群饲养。

（2）做好猪圈舍、周边环境、管理用具的卫生消毒工作，定期消毒，及时清理粪便，避免有细菌滋生。

（3）发生猪瘟后，可用大剂量猪瘟疫苗（10-30头份）肌肉注射，剂量一般为0.5头份/kg体重。

D. 非洲猪瘟的检测方法有哪些非洲猪瘟疫情防控方法是什么

荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。

等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。

要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。

非洲猪瘟防控注意事项

养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。

殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。

E. 非洲猪瘟用什么药，如何辨认非洲猪瘟

目前尚未研究出可以治疗非洲猪瘟的药物，只能通过各种预防措施避免猪群受到感染。1、避免饲喂泔水，防止传播病毒，同时不要用散养的方式养猪，因为外界的野猪和昆虫是传染源。2、定期打扫卫生，对养殖场内的用具进行消毒。3、禁止外来人员、车辆、其他禽畜进入养殖场。4、部分猪只出现发烧、呕吐、身体发红等症状时，需及时隔离，趁早处理。

一、非洲猪瘟用什么药

目前还未出现能够治疗非洲猪瘟的药物，只能通过各种防范措施避免猪群受到感染，一旦猪群被感染，则只能及时扑杀并对其做无害化处理。预防非洲猪瘟可采用以下方式：

1、避免对猪群饲喂泔水，以防传播病毒。不以散养的方式养猪，因为野猪、外界的昆虫属于传染源。

2、做好清洁工作，对养殖场内的用具、饲料进行消毒处理。

3、谢绝外来人员的参观，避免外来车辆和其他禽畜进入养殖场。饲料运输车进入猪场时，需严格消毒。

4、及时观察猪群的情况，若部分猪只具有发烧、呕吐、拉稀、身体发红等情况，应立即进行隔离，而且要趁早处理，降低损失。

5、发生病情后，要迅速封闭养殖场，防止外界的病毒、昆虫入侵猪场。

二、如何辨认非洲猪瘟

1、病猪的体温开始上升，达到40-42℃，持续4天左右，死亡前48小时温度才会开始下降。

2、病猪的身体上出现紫斑（鼻子、耳朵、腋下、尾巴、腹部等部位），并出现呕吐、喘气咳嗽、呼吸困难、结膜潮红充血、皮肤发红、精神萎靡等症状。

3、病猪的胃肠粘膜、淋巴结有出血现象，其眼睛、鼻子会流出浆液性或粘液性脓性分泌物。

4、病猪的粪便具有干、硬的特点，有时会出现便秘、排出脓性血粪便的情况。若为患病母猪，则会出现不孕、流产或死胎的情况。

5、病猪死亡之后，剖检时可看到其淋巴结以及肝脏、肺脏、脾脏等器官异常肿大，同时还往往伴随着淤血、出血的现象。

F. 非洲猪瘟怎么检测，潜伏几天才发现

1、免疫电泳试验：抗原于待检血清间出现白色沉淀线者为阳性。2、直接免疫荧光试验：在荧光显微镜下观察细胞，若细胞浆内有明亮的荧光团，则为阳性。3、间接酶联免疫蚀斑试验：直接用肉眼观察蚀斑，若颜色为棕色，则表示为阳性。4、酶联免疫吸附试验：对照成立后，若待检样品的吸收值大于0.3，则可以判定为阳性。

一、非洲猪瘟怎么检测

1、免疫电泳试验

若抗原于待检血清间出现白色沉淀线，则为阳性。

2、直接免疫荧光试验

在荧光显微镜下观察细胞，如果发现细胞浆内有明亮的荧光团，则表示为阳性。

3、间接酶联免疫蚀斑试验

直接用肉眼（或使用显微镜）观察蚀斑，若颜色是棕色，则表示为阳性，没有颜色则表示为阴性。

4、酶联免疫吸附试验

对照成立后（阳性血清对照吸收值＞0.3，阴性血清吸收值＜0.1），若待检样品的吸收值＞0.3，则可以判定为阳性。

5、红细胞吸附试验

将健康猪的白细胞加上病猪的血液（或组织提取物）放在37℃的环境中培养，若观察到大量的红细胞吸附于白细胞上面形成玫瑰花状（或桑椹体状），则表示为阳性。

6、间接免疫荧光试验

在长满Vero细胞的盖玻片上接种非洲猪瘟病毒，并准备未接种病毒的Vero细胞对照。试验后若对照正常，待检样品在细胞浆内出现明亮的荧光团和荧光细点，则可以判定为阳性。

二、非洲猪瘟潜伏几天才发现

1、非洲猪瘟的潜伏期

（1）一般情况下，非洲猪瘟的潜伏期为4-19天左右，潜伏期的长短与病毒的毒力、被感染猪群的抗病能力等因素有关。

（2）非洲猪瘟病毒的毒力可分为3个等级，即低毒力（潜伏期最长，发病最晚，可造成慢性、亚急性或不明显的发病）、中等毒力（潜伏期中等，临床症状有所减轻，会造成慢性或不明显症状）、强毒力（潜伏期较短，临床会表现出急性症状，而且病猪的皮肤上会出现出血点，并伴有厌食或呕吐、体温升高的情况，病死率达到100%）。

2、防控方法

（1）避免外来人员、车辆、其他动物进入养殖场，场内的用具、饲料都要严格消毒。

（2）按时灭杀场内的昆虫，避免传播病毒，每年春秋季节要定期给猪群注射疫苗，断奶仔猪和新购买的猪要做好防疫注射，成年猪要注射1次猪瘟兔化弱毒疫苗。

（3）新购买的猪要隔离观察30天，待确定无病后为其注射猪瘟疫苗，注射后才能混群。若猪场处于猪瘟常发疫区，则仔猪达到21-30日龄便要注射1次，达到55-60日龄后再注射1次。

G. 非洲猪瘟是什么样的疫病

非洲猪瘟，顾名思义，是最早在非洲发现的一种危害养猪业的烈性传染病，于1921年首次出现于肯尼亚，直到20世纪中叶侵入欧洲，蔓延到南美和加勒比地区。2007年以来，在全球多个国家扩散、流行，特别是俄罗斯及周边地区。2018年传入中国。目前虽然几次疫情已经得到有效处置，可大家仍然担心：现在吃猪肉到底安全吗？钱报记者请来杭州市疾控中心的专家，为大家解答非洲猪瘟和猪肉安全消费的相关问题。
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，其强毒株对生猪致病率高，最高可达100%。目前尚没有可用于治疗的特效药，也没有可用于预防的疫苗，所以一旦发生非洲猪瘟疫情，必须对猪群进行扑杀并做无害化处理。
世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是重点防控的外来病。但是我们不用太担心，因为非洲猪瘟不是人畜共患病，非洲猪瘟病毒不感染人。
农业农村部在确认疫情后，根据《非洲猪瘟疫情应急预案》及时启动Ⅱ级应急响应，并派出专家组赴疫区指导开展疫情处置和排查工作。
一是当地官方迅速组织有关部门，划定疫点、疫区、封锁区，每个封锁区出入口都设立消毒站和岗哨，严格消毒出入人员、车辆和物品，确保封锁区内的生猪及猪产品都运不出去。二是对疫点和疫区内所有生猪进行扑杀及无害化处理；对排泄物、被污染或可能被污染的饲料、垫料和污水进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、猪舍、场地等进行彻底消毒。三是要求其他养殖户封闭饲养生猪，采取隔离防护措施，尽量避免与野猪、钝缘软蜱接触；严禁使用未经高温处理的餐馆、食堂的泔水或餐余垃圾饲喂生猪；一旦出现不明原因死亡异常增多且有猪瘟类似症状的，及时上报兽医部门。

H. 怎么区分非洲猪瘟强弱性

ASF（非洲猪瘟）最重要的鉴别诊断是猪瘟，也被称为猪霍乱，猪瘟病毒属于黄病毒科的瘟病毒属成员。该疾病临床表现与ASF相似。急性猪瘟（CSF）呈现出和急性ASF几乎相同的临床症状和死后病变，并且死亡率高。临床症状包括高烧、缺乏食欲、嗜睡、出血（在皮肤、肾脏、扁桃体和胆囊）、结膜炎、呼吸困难、虚弱、蜷缩、紫色变色皮肤，并在2-10天内死亡。实验室检测，是区分两种疫病的唯一方法。在诊断确诊之前尝试紧急免疫猪瘟（CSF）疫苗是不明智的，因为在紧急接种疫苗过程中，ASF很容易通过未经培训的人员传播。

I. 非洲猪瘟最简单的辨认方法

非洲猪瘟最简单的辨认方法：非洲猪瘟发病根据周期程度可分为1-5个阶段，每个阶段非洲猪瘟症状重要表现也不同，其最突出和容易辨识的：非洲猪瘟感染的病猪持续高热，体温达到40℃-43℃，皮肤发红，有出血点。有的也会出现无症状突然死亡，这种只能通过剖析辨识。

具体可参考下图：

非洲猪瘟最变淡的辨认方法

在多次于非洲猪瘟抗击中，铁兰32非洲猪瘟防控小组发现：随着非洲猪瘟毒株的变异，其症状体征也不同。特别是区别于传统猪瘟。可以网络搜一下铁兰32非瘟防控小组对非洲猪瘟进行的一些研究可跟踪分析资料。

J. 怎样判断猪是否得了非瘟

从以下几个方面来判断：

1、临床症状：病猪体温升高，精神不振，常常卧底不动，不愿走动，呼吸困难。有的病猪在耳朵、鼻子和脚部等身体局部有出现紫色斑，还有的少数病猪会有站立不稳、排血便、倒地抽搐现象。

2、剖检症状：非洲猪瘟患猪，在病死后，对其进行解刨，它有一个非常典型的症状，就是脾脏肿大，颜色呈深红色。结合临床症状，如果出现有这个症状，病猪很有可能感染的就是非瘟了。

3、实验室确诊：需要确诊，就需要对病猪进行实验室诊断，采取样品，若被感染，可检测到非洲猪瘟病毒。

(10)非洲猪瘟病毒鉴别国标方法扩展阅读：

非洲猪瘟防控措施有

1、加强环境管理。保证猪舍卫生、温度适宜、通风良好。猪饲料和饮用水，以及器具，注意每天更换与清洁。对养猪场周围环境进行定期消毒，水源进行定期检查是否污染。猪的粪便要及时清理，切勿长时间堆积。

2、灭蚊蝇。蚊蝇、老鼠、昆虫是本病的传播途径，因此要注意防范，灭蚊蝇，防止其在猪舍内。

3、加强消毒。无论是猪舍、猪用器具还是外来车辆，都应执行严格的消毒制度。

4、封闭管理。禁止闲杂人员进入猪舍，以及接触猪。外进仔猪或种猪，应提前进行了解，做好检验，避免进入带病毒猪。

5、禁止泔水喂猪。禁止餐厨剩余饭菜喂猪，坚决做到不用泔水喂猪。

6、一旦发生非洲猪瘟，要及时上报当地相关部门，采取应急科学处理，病死猪要进行无害化处理。养猪场内要进行全面消毒，短期内暂时不先不要养猪，过一时期后再进行养殖。