报告基因检测方法原理

❶ 如何获取目的基因的原理及方法

目的基因片段的获取：目的基因的组成：一个能转录翻译的结构基因应包括转录启动区、核糖体识别区、编码区、和转录终止区。获得途径：1限制性内切酶酶切法2利用pcr技术直接扩增目的基因3目的基因的化学合成4通过构建基因组文库或cdna文库分离目的基因5反向转录法分离目的基因目的基因导入受体细胞：原核生物最理想受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻、棒状杆菌。真核生物应用最广的受体细胞：酵母细胞途径：1电穿孔法2基因枪法3激光微束穿孔法4显微注射法5多聚物介导法6脂质体介导转化法克隆子的筛选鉴定:克隆子的筛选方法：1根据载体选择标记基因2根据报告基因3根据pcr扩增片段4根据限制性核酸内切酶图谱分析5采用dna杂交法6应用dna芯片7dna核苷酸序列测定

❷ 什么是luciferase报告基因系统

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

❸ 基础实验重新认识（3）——荧光素酶互补（Luc）实验

【导入】
基于荧光素酶（Luciferase）的发光原理，形成了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海参荧光素酶（Renilla luciferase）。两者可与各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光值即表示两种酶的表达量多少。

图片来源[1]

Firefly luciferase和Renilla luciferase被称为报告基因，是因为在表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可监控微观层面上的分子间相互作用。

具体做法：将靶基因的的转录调控元件或5'启动子区融合在Firefly luciferase基因的上游，把3‘-UTR区或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用，或miRNA对目的基因/IncRNA的调控作用。

该系统中引入Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以消除细胞转染等因素带来的组间误差。

其中luciferase来源于细菌、萤火虫和发光海洋生物等，可以在哺乳动物细胞和植物细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。

与GFP不同之处在于luciferase的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使得Luc实验具备可定量、高灵敏度及背景低等特点。

【利用荧光素酶互补实验验证植物蛋白互作】

基本原理

在验证植物蛋白互作时，荧光素酶互补实验 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究[2]。

图片来源[2]

目前, 应用最为广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫 (firefly luciferase), 该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白 (大小为62 kDa)。

实验中, 荧光素酶蛋白被切成 N端 和 C端 2个功能片段, 即 NLuc (2–416AA) 和 CLuc (398–550AA) 。

在一个实验体系中, 待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合, 如果2个目标蛋白相互作用, 则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装, 从而发挥荧火素酶活性, 即分解底物产生荧光 。

实验过程

将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌 (Agrobacterium) 后注射烟草叶片。24–48小时后，加入反应底物荧火素, 利用植物活体分子影像系统 (CCD imaging system) 或luminometer来定性定量检测荧光强度, 以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度。

载体图谱

❹ 检测基因表达的方法有哪些

基因工程第四步中包括导入检测，转录检测和翻译检测，方法分别是dna分子杂交技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术。有的还可在个体水平是进行检测，如抗性检测等

❺ 检测基因表达的方法

主要用探针检测mRNA或用抗体检测出表达的蛋白质(转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测)

一、外源基因转录水平的鉴定

基因表达分为转录及翻译两阶段，转录是以DNA（基因）为模板生成mRNA的过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白质的过程，检测外源基因的表达就是检测特异mRNA及特异蛋白质的生成。所以基因表达检测分为两个水平。

即转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测。转录水平上的检测主要方法是Northern杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测RNA链。和Southern杂交相同，Northern杂交包括斑点杂交和印迹杂交。

也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方法检测外源DNA在植物体内的转录表达。其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录，然后再经PCR扩增。

如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录。此法简单、快速，但对外源基因转录的最后决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。

二、外源基因表达蛋白的检测

表达蛋白的检测方法有三种：

1、生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；

2、免疫学检测法：通过目的蛋白（抗原）与其抗体的特异性结合进行检测，具体方法有Western杂交、酶联免疫吸附法（ELISA）及免疫沉淀法；

3、生物学活性的检测。

Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离抗原（Antigen）固定在固体支持物上（如硝酸纤维素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不同，据此可确定特定的抗原存在与否以及相对丰度，或者蛋白质是否遭到降解等。

蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，温育，以封闭非特异性位点，然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体杂交，抗原-抗体结合，再通过放射性自显影或显色观察。

(5)报告基因检测方法原理扩展阅读

外显子与内含子表达过程中的相对性 从内含子与外显子的定义来看，两者是不能混淆的，但是真核生物的外显子也并非都“显”（编码氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外显子完全“不显”之外，几乎全部的结构基因的首尾两外显子都只有部分核苷酸顺序编码氨基酸，还有完全不编码基酸的外显子，如人类G6PD基因的第一外显子核苷酸顺序。

已发现一个基因的外显子可以是另一基因的内含子，所这亦然。以小鼠的淀粉酶基因为例，来源于肝的与来源于唾液腺的是同一基因。淀粉酶基因包括4个外显子，肝生成的淀粉酶不保留外显子1，而唾液腺中的淀粉酶则保留了外显子1的50bp顺序，但把外显子2与前后两段内含子一起剪切掉，经过这样剪接，外显子2就变成唾液淀粉酶基因中的内含子。

同一基因在不同组织能生成不同的基因产物来源于不同组织的类似蛋白，可以由同一基因编码产生，这种现象首先是由于基因中的增强子等有组织特异性，它能与不同组织中的组织特异因子结合，故在不同组织中同一基因会产生不同的转录物与转录后加工作用。

此外真核生物基因可有一个以一的poly(A)位点，因此能在不同的细胞中产生具有不同3’末端的前mRNA，从而会有不同的剪接方式。由于大多数真核生物基因的转录物是先加poly(A)尾巴，然后再行剪接，因此不同组织、细胞中会有不同的因子干预多聚腺苷酸化作用，最后影响剪接模式。

❻ 什么是报告基因检测法

报告基因（reporter：gene）是指其编码产物能够被快速地测定的一类特殊用途的基因，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并可以方便快速检测其表达活性。

可见报告基因实质是起到了判断目的基因是否已经成功地导入到受体细胞并且表达的标记基因的作用。作为理想的植物报告基因应具备以下特征：
1、编码的产物是惟一的，并且对受体细胞无毒。
2、表达产物及产物的类似功能在未转化的细胞内不存在，即无背景。
3、产物表达水平稳定，便于检测等。

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❼ GFP是怎么报告DNA的基因的

这个和基因的调控有关系了，基因不是自己想表达就表达的，而是由一定的调控元件来控制的，常见的有启动子，增强子等等，在做报告基因的时候，通常会把报告基因如GFP这种序列加在目的基因的C端或者N端，也有加在中间的做成融合的，或是在启动子下游独立让他表达的。这样其实这个GFP蛋白的表达也是受到目的基因相同的调控元件调控的，即只有细胞在表达你目的基因的时候，GFP才会以融合蛋白或非融合蛋白的形式表达出来

❽ 转基因的植株要怎样检测

在植物遗传转化中，外源基因导入植物细胞的频率是相当低的。在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多的一小部分细胞获得了外源DNA，而目的整合到基因组并实现表达的转化细胞则更少。

因此，必须采用一定的检测方法，才能筛选和鉴定出含有目的基因的重组体。目前已发展出一系列的转基因植物的筛选和鉴定方法。在这些鉴定和筛选方法，根据检测的基因功能来划分，可分为调控基因（包括启动子终止子等）检测、选择标记基因检测和目的基因直接检测。

根据检测的不同阶段区分，有整合水平检测和表达水平的检测，基因整合检测方法主要有Southern杂交、PCR、PCR-Southern杂交、原位杂交和DNA分子标记技术法，表达水平的检测包括转录水平检测和翻译水平检测，转录水平的检测法有Northern杂交和反转录PCR（reverse：transcribed：PCR，RT-PCR）检测，翻译水平的检测有酶联免疫吸附法（enzyme：linked：immuno：sorbent：assay，ELISA）和Western杂交等，其中最简便和使用广泛的表达水平的检测是报告基因检测法。由于这些方法的具体操作已在其他章节（课程）介绍过，这里只侧重介绍基于选择标记基因和报告基因的筛选和鉴定方法。