T淋巴细胞亚群检测方法

㈠ T淋巴细胞可分为哪些亚群有何功能

T细胞是相当复杂的不均一体、又不断在体内更新、在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群，但分类原则和命名比较混乱，尚未统一。按免疫应答中的功能不同，可将T细胞分成若干亚群，一致公认的有：
辅助性T细胞（Helper T cells,Th），具有协助体液免疫和细胞免疫的功能；
抑制性T细胞（Suppressor T cells,Ts），具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能；
效应T细胞（Effector T cells,Te），具有释放淋巴因子的功能；
细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells,Tc），具有杀伤靶细胞的功能；
迟发性变态反应T细胞（Td），有参与Ⅳ型变态反应的作用；放大T细胞（Ta），可作用于Th和Ts，有扩大免疫效果的作用；
处女或天然T细胞（Virgin or Natural T cells），他们和抗原接触后分化成效应T细胞和记忆T细胞；
记忆T细胞（Tm），有记忆特异性抗原刺激的作用。T细胞在体内存活的时间可数月至数年。其记忆细胞存活的时间则更长。
其中，Th细胞又被称为CD4+细胞，因为其在表面表达CD4(cluster of differentiation 4）。通过与MHCⅡ（主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex）递呈的多肽抗原反应被激活。MHCⅡ在抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APCs）表面表达。一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协助免疫反应。Tc细胞又名为CD8+细胞，其表面表达CD8.这类细胞可以通过MHCI 与抗原直接结合。
流式细胞分析仪FCM根据淋巴细胞表面标志的不同来检测各淋巴细胞亚群：
淋巴细胞主要包括T淋巴细胞（CD3+），B淋巴细胞（CD19+），NK细胞（CD16+CD56+），

T淋巴细胞
其中T淋巴细胞可进一步测定辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群（CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+）、功能亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亚群（CD95+）等。
T细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类：
1、细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，也被称为杀手T细胞。
2、辅助T细胞（helper T cell）在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。 T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。
3、调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种，目前研究最活跃的是CD25+ CD4+ T细胞。
4、记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作用。但暂时没有发现记忆T细胞表面存在非常特异的表面标志物，相信随着研究的深入，人们对记忆T细胞将会有一个更深入的了解。

㈡ 如何分析流式细胞仪检测t淋巴细胞亚群结果

最常见的是分析CD4， CD8亚群。

先在FSC， SSC散点图上划出淋巴细胞gate。然后在此gate基础上选取T细胞标志染色阳性的细胞群（一般是CD3）。在把CD34阳性的细胞根据CD4 和CD8染色情况形式为散点图，得到CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, 以及双阳性的比率。如果还有其他细胞标志的染色，再进一步分析。

㈢ 今天检查淋巴细胞亚群

淋巴细胞亚群分析正是检测免疫功能的重要指标
它能反映机体当前的免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等），对分析发病机制，观察疗效及检测预后都有重要意义

一、什么是淋巴细胞亚群？

人体的免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞等。T细胞主要参与细胞免疫，表达CD3抗原；B细胞主要参与体液免疫，表达CD19抗原；NK细胞表达CD16和/或CD56，在机体中不依赖抗原刺激自发地发挥细胞毒效应。其中，T细胞又包括辅助T细胞（Th）和抑制T细胞（Ts），它们分别表达CD4和CD8。

2、CD4+/CD8+细胞比值改变：表明机体细胞免疫功能紊乱。不管是CD4+或CD8+细胞数发生变化均影响该比值。（1）CD4淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂患者。（2）CD8淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。（3）CD4/CD8>2.5表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自体免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。（4）CD4/CD8<1.4称为“免疫抑制”状态，常见于：A.免疫缺陷病，如艾滋病时的比值常显着小于0.5；B.恶性肿瘤；C.再生障碍性贫血、白血病；D.某些病毒感染。CD4/CD8降到1.0以下为“倒置”，是较为明显的异常。（5）若移植后CD4/CD8较移植前明显增加，则可能发生排斥反应。

3、NK细胞（CD3-CD16+和/或CD56+）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。

四、什么人该检测淋巴细胞亚群？

原则上来讲，在机体的免疫（防御、自稳、监视）功能受损的情况下要考虑检查淋巴细胞亚群，下面列出了一些常见情况：

（1）免疫防御功能受损（反复、严重、多重感染，常规治疗效果不佳）

（2）免疫自稳和耐受功能受损（过敏性疾病、自身免疫/炎症疾病表现）

（3）免疫监视功能受损（肿瘤性改变）

（4）其他特殊情况（血常规中淋巴细胞明显异常、家族免疫缺陷病史、长期使用免疫抑制剂）

近年来，新的细胞表面位点的发现、新单克隆抗体的问世、高新仪器的更新换代等都为淋巴细胞亚群检测的发展提供了可能性，进一步为临床诊断和治疗提供指导和帮助。希望大家也能多多了解和关注淋巴细胞亚群检测，为自己的免疫功能保驾护航。

㈣ 如何运用流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群分析

简单的概括：

1、先在FSC/SSC散点图gate出淋巴细胞；
2、然后把淋巴细胞显示到柱状图，gate出CD3阳性的（T细胞）；
3、再把T细胞显示到散点图，横坐标，纵坐标分别为CD4和CD8。

㈤ T细胞亚群检测有何临床意义

检测淋巴细胞亚群可以了解患者机体的免疫功能是否处于平衡状态。某种细胞亚群所占百分比过高或过低，都提示存在免疫功能的紊乱。

T淋巴细胞亚群在某些临床疾病，如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病、病毒感染、恶性肿瘤等均有异常改变。因此，T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生发展、了解疾病的机制、指导临床治疗都有极其重要的意义。

目前，最为快速和准确的T细胞亚群的检测方法是流式细胞术荧光标记法，即用抗人T细胞表面分化抗原的单克隆抗体进行免疫荧光标记，通过流式细胞仪检测T淋巴细胞各亚群的百分率或绝对计数。

(5)T淋巴细胞亚群检测方法扩展阅读：

T细胞亚群检测临床上常用来观察的指标：

1、CD3＋：成熟T淋巴细胞的标志；

2、CD3＋CD4＋CD8－：T辅助／诱导细胞的标志；

3、CD3＋CD8＋CD4－：T抑制／杀伤细胞的标志；

4、CD25＋：白介素2受体的标的标志，即激活的T淋巴细胞。

健康人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围为：CD3＋：61％～85％；CD3＋CD4＋CD8－：28％～58％；CD3＋CD8＋CD4－：19％～48％；CD4＋／CD8＋：0.9～2.0。

㈥ 如何运用流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群分析

简单的概括：

1 先在FSC/SSC散点图gate出淋巴细胞
2 然后把淋巴细胞显示到柱状图，gate出CD3阳性的（T细胞）
3 再把T细胞显示到散点图，横坐标，纵坐标分别为CD4和CD8

㈦ 简述T细胞功能测定的常用方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。1．体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。2．细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。体液免疫检测法1.凝集反应。颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。⑴玻片法：多用于抗原的定性检测。⑵试管法：多用于抗体的定量检测。2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。2．沉淀反应。可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多糖、类脂、蛋白质等。1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩散的沉淀反应。此法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。本法常用于定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。单克隆抗体技术3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。3．中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。4.免疫荧光法（荧光抗体法）。是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目的。包括直接法和间接法。5．酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。6．溶血空斑试验。7．免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)抗体抗原反应创建的DNA印迹术(Southernblotting）基础上发展起来的新型免疫生化技术。细胞免疫检测法近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术，不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。二十一世纪初期，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。1．淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。2000年开始出现一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色成分。该产物的多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪(595nm）测量光密度，作为MTT法的指标。2．E-花环法。人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经37℃培养5～10分钟后放4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞，此法可用来分离T细胞。3．T细胞亚群检测。4．细胞毒试验。Tc细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞等对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。抗体制备常用的检测方法是51Cr（铬）释放法，将51Cr-Na2CrO4盐水溶液与靶细胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如NK细胞的靶细胞为K562），于37℃培养1小时左右，51Cr即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待测细胞毒的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50:1或100:1），靶细胞杀伤越多，释放到上清液中的游离51Cr就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。5．巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药(10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2大小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡，内含巨噬细胞。取水泡液0.5ml加鸡红细胞悬液0.01ml，37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检，计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观察。6．移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因子(MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无MIF产生，以测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。7．时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术(time-resolvedfluorometry,TrF）是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。8．细胞因子检测技术。细胞因子的检测，2005年起在中医临床及实验室中已广泛应用。9．细胞受体的检测。受体是细胞表面标志之一，通过对受体的检测，可以了解细胞的功能，并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。

㈧ T淋巴细胞亚群的检查过程

在前散射(FSC)和侧散射(SSC)的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ(FL1)为FITC，滤过片为(530±10) nm带通，荧光Ⅱ(FL2)为PE，滤光片为(575±10) nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据isotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阴性、双阳性和单阳性区。

㈨ t淋巴细胞亚群实验的常用方法有哪些

T淋巴细胞又分为辅助性T淋巴细胞（CD3+CD4+）和抑制性/细胞毒性T淋巴细胞（CD3+CD8+）。在正常情况下，各群淋巴细胞的数目和相对比例都在一定的范围内。 1. 总T（CD3+）淋巴细胞的绝对计数： 就如白细胞计数一样，该细胞的绝对计数(个/ul)一般也

㈩ T淋巴细胞亚群检测【类A】

[项目名称]T淋巴细胞亚群测定

[参考值]
免疫荧光法、桥联酶免疫检测法、SPA花环法：
CD3+细胞阳性率71．5％±6．2％
CD4+细胞阳性率45．7％±5．3％
CD8+细胞阳性率27．9％±5．0％
CD4／cD8比值为1．66±0．33
流式细胞术：
CD3+细胞阳性率61％一85％
CD4+细胞阳性率28％～58％
CD8+细胞阳性率19％一48％
CD4/CD8比值为0．9--2.0

[临床意义]T淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等)的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。
1．CD4淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者。
2．CD8淋巴细胞增多：见于自身免疫病，如SLE、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。
3．CD4／CD8比值异常：艾滋病患者比值显着降低，多在0．5以下。比值降低的还有：SLE肾病、传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、骨髓移植恢复期等。比值增高见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。此外还可用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4/CD8较移植前明显增加，则可能发生排异反应。