A. 一文读懂肿瘤精准用药基因检测
一文读懂肿瘤精准用药基因检测
根据世界卫生组织（WHO）统计数据，全世界约有60%的人死于癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病这4大类疾病，而癌症则是最主要的死因之一。2008年全球死于癌症的患者达760万人，占全球死亡人数的13%，我国卫生部第三次全国死因调查结果也显示，癌症已成为我国仅次于心脑血管疾病的第二大死亡原因，占死亡总数的22.32%，并成为我国城市的首位死因。
目前，恶性肿瘤逐年升高的发病率及其巨大的医疗费用等因素，使得大家“谈癌色变”。好在治疗手段发展快速，包括手术和放疗的局部治疗和抗肿瘤药物的全身治疗类。其中，药物治疗已成为当今临床治疗肿瘤的重要手段之一。而提到肿瘤药物治疗，就不免会提到基因检测技术。对于医生和患者来说，基因检测是“既熟悉又陌生”的高科技！如何能让医生或患者通俗易懂地了解肿瘤基因检测，那可真是一门技术活。 今天，我就针对肿瘤用药的相关基因检测为大家做一期干货分享。
○ 为什么要做肿瘤基因检测？
○ 肿瘤用药基因检测到底检测了什么？有哪些抗肿瘤药物需要做基因检测？
○ 是不是检测的基因越多越好？
○ 基因检测的方法有哪些？哪一种是最好的？
○ 肿瘤基因检测选取什么样本才是最好的？
1. 为什么要做肿瘤基因检测？
肿瘤基因检测的主要原因在于肿瘤是一类高度异质性疾病。也就是说，哪怕患的是同一种肿瘤，不同的患者也需要根据其实际情况采用不同的治疗方案，尤其是抗肿瘤用药的选择。不同患者对不同抗肿瘤药物的敏感程度差异巨大，故肿瘤临床治疗需要制定个体化的精准方案。而基因检测是评估患者使用药物效果非常重要的一环，能从分子层面给医生用药予精确的指导。
2. 肿瘤用药基因检测到底检测了什么？有哪些抗肿瘤药物需要做基因检测？
实际上，不同类型抗肿瘤药物的基因检测项目是不同的。所以， 首先我为大家全面介绍一下抗肿瘤药物的类别，再介绍各种类抗肿瘤药物的基因检测项目。
目前，国际上临床常见的抗肿瘤药物大致可分为以下六类： 细胞毒类药物、激素类药物、靶向药物、免疫检验点抑制剂、生物反应调节剂及辅助药 。
细胞毒类药物
简介： 通常被称为“化疗”药物，此类药物主要是根据癌细胞增殖过快等生长特性杀死癌细胞，因此对具有类似特性的健康细胞也会无差别攻击，种类很多包括：
（1）作用于DNA化学结构的药物，如铂类化合物等；
（2）影响核酸合成的药物，如甲氨蝶呤、培美曲塞等；
（3）作用于核酸转录的药物，如阿霉素、表阿霉素等；
（4）作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，如伊立替康等；
（5）主要作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物，如紫杉醇等；
（6）其他细胞毒药。
基因检测目的： 评估药物对患者的有效性或安全性（毒副作用）。
基因检测类型： 基于患者对药物的代谢相关基因的多态性，评估不同化疗药物在患者体内代谢反应情况。
基因检测必要性： ⭐⭐⭐
【由于没有涉及对肿瘤细胞基因突变的分析，化疗药物基因检测还不能算是完全意义上的精准医疗，但在其他外界条件相同的情况下，化疗药物基因检测可为患者从药物受益或毒副作用两个方面提供选择参考。】
激素类药物
简介： 主要是与激素相关的恶性肿瘤类型（如女性的乳腺癌、男性的前列腺癌等）的激素调节药物，包括如他莫昔芬、来曲唑、阿那曲唑等；
基因检测目的： 与细胞毒类药物相同，激素类药物基因检测主要评估的也是药物对患者的有效性或安全性（毒副作用）。
基因检测类型： 同化疗药物。
基因检测必要性： ⭐⭐
靶向药 物
简介： 针对癌细胞上特定的“靶点”，比如某个特定的基因突变，抑制癌细胞生长直至杀死癌细胞的药物。靶向药物理论上只会抑制癌细胞，而不会对正常细胞造成显着伤害，因此副作用小很多。对于此类型药物，如果患者有相应的治疗靶点，则靶向药物有效率高，而且起效快，能迅速缓解肿瘤带来的症状，提高患者的生活质量，一定时期内能显着提高存活率。
靶向药物目前主要分为两类：大分子单抗类药物和小分子靶向药物。其中小分子靶向药物主要集中在蛋白酪氨酸激酶剂、蛋白酶和其他种类，典型代表是针对白血病的格列卫（Bcr-Abl 基因突变）和针对肺癌的易瑞沙（EGFR 基因突变）。
基因检测目的： 评估靶向药物对患者的疗效或耐药情况。
基因检测类型： 由于靶向药物类型较多，通常会检测每个靶向药物对应的肿瘤信号通路中特定基因的点突变/插入缺失/拷贝数变异/融合（结构变异）等情况，这些常被统称为“基因突变”。具体到小分子靶向药物涉及的主要基因及信号通路包括：
(1) 表皮生长因子受体（EGFR）；
(2) 血管内表皮细胞生长因子受体（VEGFR）家族；
(3) 血小板衍化生长因子受体（PDGFR）家族；
(4) 成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族；
(5) 与恶性肿瘤发生密切相关的非受体酪氨酸激酶四个家族：ABL家族、JAK家族、SRC家族以及FAK家族；
(6) 与mTOR抑制剂相关的PI3K/Akt信号通路。
基因检测必要性： ⭐⭐⭐⭐⭐
靶向药物基因检测是通过患者癌细胞基因检测，从而选择对患者有效的特定药物或方案，是真正意义上的精准医学。由于很多靶向药物有明确疗效/耐药靶点，须遵循基因检测后才可使用！不应在未做相关基因检测的情况下盲目用！
【 由于肿瘤的异质性和进化，靶向药物使用一段时间后可能会出现抗药性，需要换药，故靶向药物基因检测配合药物疗效最好定期检测。】
免疫检验点抑制剂
简介： 目前此类药物常被简称为“免疫药物”，主要是通过抑制癌细胞的抑制免疫应答，从而激活T细胞功能，让患者自身的免疫系统杀死变异的肿瘤细胞，主要包括了近年来大火的PD-1/PD-L1抑制剂以及CTLA-4抑制剂。该类型药物的很多响应患者会长期受益，一小部分患者甚至被治愈，是目前抗肿瘤药物的重点研发方向之一。
基因检测目的： 评估患者对此类药物可能的受益。
基因检测类型： 此类药物的基因检测主要是评估受益的生物标记，包括：
（1）PD-L1表达，只针对PD-1/PD-L1抑制剂药物；
（2）MMR/MSI检测，患者的DNA错配功能检测，两者属于同一类型检测，微卫星不稳定性（MSI）可以侧面反应MMR系统是否工作良好；
（3）肿瘤突变负荷（TMB）。
基因检测必要性： ⭐⭐⭐⭐
目前免疫检测点抑制剂类药物最大问题是有效率不高，仅在10%~20%，加上其目前费用较高，所以，通过基因检测评估药物可能的受益还是很有必要的.
【免疫药物的以上三个类型生物标记的基因检测，目前实际应用中仅可以选择其中之一。一般来说，如果是肺癌患者，由于目前上市的针对肺癌的此类药物基本都是PD-1/PD-L1抑制剂，建议选择PD-L1表达检测；如果是结直肠癌患者，则建议选择MSI检测，当然也可以根据实际情况选择同时检测综合评估或盲用药。】
生物反应调节剂
简介 ：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤，如干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽类。
基因检测目的： 目前此类药物基本不需要做基因检测。
基因检测类型： 无。
基因检测必要性： 无。
辅助药
简介： 肿瘤治疗中，辅助其他药物疗效或减轻其他药物带来副作用的药物，如
（1）升血药（如G-CSF、GM-CSF、白细胞介素-11、EPO等）；
（2）止呕药（如恩丹西酮、盐酸格拉司琼等）；
（3）镇痛药（如阿司匹林、扑热息痛、可待因、曲马多、吗啡、芬太尼等）；
（4）抑制破骨细胞药（如氯膦酸二钠、帕米磷酸二钠等）。
基因检测目的： 目前此类药物基本不需要做基因检测。
基因检测类型： 无。
基因检测必要性： 无。
3. 是不是检测的基因越多越好？
答案是否定的，要根据实际需要评估的药物，选择相对应的基因检测项目，尤其是靶向药物，每个药物的疗效/耐药靶点基因是比较固定的。
随着高通量测序技术（NGS）技术的崛起，商业市场将几个到成百上千个基因打包检测，即测序Panel 或“基因套餐”，但是由于目前已上市的靶向药物比较固定，当测序基因数量覆盖足够靶点基因后，再增加基因数量未必能进一步提供更多的靶向药物指导，这些Panel 提供的往往是一些额外的评析，如遗传评估；此外，大Panel 基因测序还可以用来进行拟合计算TMB。但目前基于大Panel 的TMB计算方法没有统一的标准，也没有统一的定论。
此外，Panel的测序结果还和其测序覆盖度（可覆盖的目前基因区域）、测序深度（可使用测序数据量衡量）等相关。基于以上几点， 对于NGS的测序Panel 大小选择应根据实际需求判断，而非单一按照基因量多少选择。
4.基因检测的方法有哪些？
哪一种是最好的？
基因检测的方法是直接与基因检测类型相关联的，每种基因检测类型都有较为合适基因检测方法。由于基因检测体系比较复杂，最好的方法是根据需要评估的药物选择相应的检测项目。下面我为大家简单总结一下各个基因检测类型对应的常见检测方法：
(1) 基因多态性：PCR；
(2) 相对表达检测：荧光定量PCR；
(3) 点突变/小片段插入缺失：PCR；
(4) 大片段插入缺失/拷贝数变异/融合（结构变异）：FISH；
(5) 多基因多类型突变（相对表达检测除外）：NGS；
(6) 多肽和蛋白质检测：免疫组化（IHC）。
5 . 肿瘤基因检测选取 什么
样本才是最好的？
目前对于肿瘤基因检测，组织样本仍是金标准，且部分基因检测项目仅组织样本才可以实现。因此， 有条件的情况下，应优先选择组织样本 。 若无法取得组织样本，最好是临床处于中晚期（临床III期后）的患者再选用外周血进行ctDNA基因检测 。同时，外周血靶向药物ctDNA基因检测最好是在没有经过任何治疗之前进行，因为放化疗和靶向治疗均会对外周血ctDNA检测结果产生影响。 按照检出率，新鲜组织>石蜡切片>胸腹水上清>胸腹水细胞>外周血。
此外，由于外周血ctDNA在外周血cfDNA中的比率与肿瘤的大小和进展呈正相关，所以，ctDNA检测（肿瘤液态活检）目前在临床上除了肿瘤用药指导外，还有另一项更为重要的应用可能—— 肿瘤进展监控 ，具体的应用包括：
(1) 肿瘤早诊（肿瘤早期筛查）
液体活检（包括ctDNA检测）可以通过血液等检测在健康的、无症状的人群中早期发现癌症，这是一项极具潜力的技术，可以和全基因组测序相结合，实时检测癌症的发生风险，一个可以实时的检测癌症发生的情况，一个则可以了解家族遗传和正常的癌症发生概率（比如原癌基因P53和乳腺癌BRAC基因检测等），相结合之下将会更好地预防癌症。
(2) 肿瘤治疗疗效跟踪
虽然ctDNA水平在不同的患者之间有很大的差异，但随着时间的推移，单个患者的ctDNA水平与肿瘤负荷和治疗效果的变化密切相关。一些研究表明，当肿瘤细胞死亡导致ctDNA释放增加时，ctDNA水平可能会在治疗开始后短暂升高。然而，在治疗开始1~2周后，对治疗有反应的患者的ctDNA水平急剧下降。在某些方面，ctDNA的变化在预测治疗效果方面要优于标准肿瘤标志物。这也是ctDNA可以在临床上用作癌症治疗效果长期跟踪的一个重要原因。
(3) 肿瘤复发监控
目前来说，实体瘤的主要治疗方式依旧是手术，目前还无法在手术后立即确定哪些患者含有残余病灶，而任何一个残留的微小癌细胞病灶都可能导致癌症复发。在已有的研究中，术后ctDNA检测可以预测乳腺癌、肺癌、结直肠癌和胰腺癌的残留病灶和肿瘤复发。这使得ctDNA成为很有潜力的术后管理策略。 目前来说，ctDNA检测已经可以帮助癌症患者更好地管理和治疗癌症，而在未来，ctDNA必将成为癌症治疗中不可或缺的一环。
结语
最后，我想说，肿瘤用药基因检测的核心目标是给予用药指导，且由于技术原因，医生或者患者很难直接读懂基因检测的结果，这就需要基因检测提供商提供对应的高标准解读，并根据解读结果为患者和医生提供相关用药评估。所以，医生或者患者要基于相应的目标抗肿瘤药物，合理选择相应的基因检测项目。
· END ·
B. Duplex UMI-ctDNA测序技术
同一癌种的不同患者，同一个肿瘤患者的不同治疗阶段、同一肿瘤组织的不同区域，肿瘤的生物学特征均存在一定的差异。 液体活检 既可以克服 组织检测 的 异质性 ，又具有 简便、安全、无创、实时 等特点，尤其是对于无法进行手术或穿刺，又或者肿瘤位置导致取样困难的患者而言，液体活检是一项可以弥补组织检测局限性的方法，近年来在 肿瘤靶向治疗 、 耐药监测的实时评估 等方面发挥着重要的作用。
目前液体活检的靶标包括： 游离的循环肿瘤细胞 （CTCs）、 循环肿瘤DNA （ctDNA）、 循环RNA （ctRNA）和 外泌体 （携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等）。
ctDNA 是肿瘤细胞在 坏死 、 凋亡后 释放的一种游离DNA（ cfDNA ），在血液中的半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化。
目前用于ctDNA液体活检的技术主要有 ARMS-PCR 、 数字PCR（ddPCR） 和 第二代测序（NGS） 。
NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是应用最广泛的的基因检测技术。但由于NGS的实验流程技术较为复杂，在 文库构建 、 目标区域捕获 及 测序过程中 不可避免的会引入一些扩增和测序的错误，这些错误我们把它们叫做 背景噪音 ，而ctDNA检测 往往突变频率较低 ，受到背景噪音 干扰较大 ，来自ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成 假阴性 或 假阳性 结果，这就限制了ctDNA检测的 灵敏度 和 特异性 。
分子条形码技术（UMI）
分子条形码又称 分子标签 （Unique Molecular indentifier，UMI），它的 原理 就是给 每一条原始DNA片段 加上一段 特有的 标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据 不同的标签序列 我们就可以区分 不同来源的DNA模板 ，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正的携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
①2012年5月，Tim Forshew等人率先开发了基于分子标签的TAm-Seq方法。
②2012年9月，Michael W. Schmitt等利用双链分子标签技术将错误率显着降低。它的技术原理如下：
C. 什么是Oseq-ctDNA肿瘤基因检测
人体外周血中存在循环DNA，来源于细胞坏死、凋亡及分泌等，其中源于肿瘤细胞释放的循环DNA称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。Oseq-ctDNA肿瘤基因检测可以从外周血中测定ctDNA，分析肿瘤药物相关的508个基因点位变异情况，全面、准确解读88种相关肿瘤药物与基因的关系，辅助医生制定个性化用药诊疗方案。简单来说Oseq-ctDNA可以通过基因检测为接受化疗的患者提供靶向用药指导。
D. ctDNA甲基化检测在肿瘤诊疗中的价值
癌症患者血浆或血清中的循环肿瘤DNA（ctDNA）为肿瘤的非侵入性取样提供了机会。这种"液体活检"允许对DNA进行拷贝数变异、特异性突变以及表观遗传改变的检测，并可以进行病情实时"跟踪"，从而指导和改善癌症患者的整个诊疗过程。与检测肿瘤特异性突变相比，ctDNA在特定基因区域的异常甲基化具有高度一致的特征，使得ctDNA甲基化检测更广泛地适用于肿瘤的诊断、监测，预测治疗反应和预后判断。因此，ctDNA甲基化检测被认为是癌症诊断和风险评估最有价值的方法之一。
循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，是循环游离DNA（circulatingcell-free DNA，cfDNA）的一部分。健康人群中大部分cfDNA的长度在70~200 bp，但肿瘤患者的ctDNA长度可能为200 bp甚至超过1000 bp。ctDNA含有与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变、重排、扩增、微卫星改变、表观遗传修饰等。当肿瘤DNA进入血液时，这些基因缺陷模式在血浆和血清中也可被检测到。
甲基化是DNA的一种重要修饰，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在CpG双核苷酸的C上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。人基因组中60%~90%的（CpG）都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，主要位于基因的启动子和外显子区域，长度为300~3 000 bp。靠近或位于启动子区域的异常甲基化一般会抑制转录，沉默相关基因的表达。在肿瘤中，抑癌基因和DNA修复基因启动子区域的异常高甲基化使得抑癌基因沉默和修复基因失活，从而丧失对肿瘤发生的抑制作用，也是目前肿瘤甲基化研究的主要方向。与其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化作为最早发现的表观修饰途径之一，其异常甲基化模式在不同肿瘤组织中具有高度特异性。特征性的甲基化"指纹"图谱可用于癌症早期诊断与分期、疗效评估、复发监测和预后判断等。
ctDNA甲基化检测在癌症诊疗应用中，基于血液标本一定程度上可以克服实体瘤组织标本的局限性，例如：（1）ctDNA在血液中半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化；（2）可以克服肿瘤组织取样的异质性；（3）重复活检可以追踪肿瘤的克隆演变；（4）可以识别转移性肿瘤。因此，在过去的30年中，DNA甲基化被认为是有希望检测癌症的生物标志物[1]。
一、ctDNA甲基化检测技术方法及研究思路
1．常用检测方法及技术难点：
目前，ctDNA甲基化标志物的研究思路已经比较明确。首先，通过芯片或二代测序对肿瘤组织和正常组织进行全基因组范围的甲基化信号扫描，寻找肿瘤特异的甲基化标志物位点；然后再针对这些位点对ctDNA进行性价比更高的靶向测序，验证标志物性能。虽然研究思路比较清晰，但甲基化检测技术的诸多局限也一直困扰着研究人员。一方面，血液ctDNA含量很低，某些特定类型的肿瘤或中晚期肿瘤有可能达到20 ng/ml。技术上最大的挑战是需要从含有不同数量cfDNA的血液样品中鉴定极少量的ctDNA。另一方面，目前甲基化检测技术基本上均基于亚硫酸氢盐（bisulfite，BS）使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不变。目前基于BS的甲基化检测技术主要包括PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术[2]，其中扩增的应用较广泛。BS处理后未甲基化的C变U，PCR扩增后U配对T，因此扩增后DNA变为富含A和T（AT-rich），与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来。但是，研究发现扩增过程中甲基化状态的DNA（GC含量高）易产生扩增偏好，在文库中富集。所以，需要在高效捕获BS DNA片段的同时，还要保证甲基化信号在扩增过程中均匀放大，不走样。
2．近年来研究思路的突破方向：
过去研究多聚焦于单基因启动子区甲基化，研究发现多基因组合检测可以进一步提高DNA甲基化特征的特异性和敏感性。随着生物信息技术的快速发展，甲基化检测逐渐由单基因向多基因组合以及全基因组水平拓展。2017年Nature Genetics杂志发表的一篇文章定义了147 888块紧密耦合的CpG位点，称为甲基化单倍体块（CpG methylation haplotypes block，MHB）。经过对61个全基因组BS测序数据集进行分析，并使用101个BS测序数据集和637个甲基化芯片数据集进行验证，证实大小为95 bp并含有≥3个CpG位点的MHB在大约170 bp的cfDNA中更容易被检测到。最后使用MHB对59例肺癌或结直肠癌患者的肿瘤组织和循环cfDNA进行了评估，发现借助肿瘤特异的MHB模式可以进一步提升甲基化指纹的准确性，从痕量检测中发现甲基化的组织来源[3]。2017年，通过机器学习对全基因甲基化谱进行分析后，发现了4种常见肿瘤的特异性甲基化分子标志物，包括肺癌19个、结直肠癌6个、乳腺癌15个、肝癌3个。这些标志物能够从正常组织中区分出肿瘤，准确率大于95%。进一步对结直肠癌30例肝转移灶和34例肺转移灶进行无监督分层聚类分析，发现高度组织特异性的甲基化特征可以正确诊断肿瘤起源，诊断正确率分别高达96.7%和94.1%[4]。与上述研究方法类似，研究人员在大样本肝癌研究中筛选出10个甲基化标志物，建立起血液肝癌的ctDNA甲基化诊断模型。经证实该模型可以区分正常人群、肝病背景（肝炎，肝硬化等）和肝癌患者，并与肝癌的肿瘤负荷、治疗反应和临床分期关联良好，再次证实了ctDNA甲基化检测的临床优势[5]。
二、ctDNA甲基化检测的临床应用
1．ctDNA反映基因启动子区高甲基化的一致特征，可以用于肿瘤诊断：
与DNA突变相比，基因特定启动子区域的异常甲基化可能是癌症的一致特征，例如，90%的前列腺癌中谷胱甘肽S-转移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）基因被甲基化[6]，96%的乳腺癌中分层蛋白（stratifin，SFN）基因被甲基化[7]，同源框蛋白A9（homeoboxA9，HOXA9）基因和锯齿状同源框蛋白1（engrailed homeobox 1，EN1）基因分别在95%和80%的卵巢肿瘤中被甲基化[8]，73%的肝细胞癌中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因被甲基化[9]。高度一致的甲基化特征使得ctDNA甲基化广泛地适用于肿瘤诊断。用于诊断的商业产品也已经面市，如基于粪便的结直肠癌筛查试验将N-myc下游调节基因4（N-mycdownstream regulated gene 4，NDRG4）与骨形态发生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因的甲基化改变与突变检测相结合，在2014年获得了美国FDA批准，是第一个基于DNA甲基化检测的诊断试验[10]。此外，Epi proColon检测分析Septin 9基因的甲基化用于全结直肠癌筛查[11]，以及Epi proLung检测分析矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox 2，SHOX2）基因甲基化用于肺癌筛查由中国FDA于2015年7月批准[12]。
2．ctDNA甲基化检测反映肿瘤负荷变化，可用于监测治疗反应：
癌症特异性ctDNA甲基化模式可用于定量肿瘤DNA，提供有关肿瘤负荷水平的信息。研究表明周期素依赖性激酶抑制因子2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因中位甲基化指数（甲基化的循环CDKN2A/总循环CDKN2A）由术前35%下降为术后3.5%[13]。在44%~68%的食管癌患者的肿瘤中检测到APC基因的甲基化[14]，食管癌患者术后血液中腺瘤性结肠息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因甲基化水平与术后肿瘤残余显着相关[15]。
除了反映手术后肿瘤负荷的下降，ctDNA甲基化还可以反映肿瘤对化疗药物的反应。目前，大多数转移性恶性肿瘤需要至少3个周期的化疗，然后才能根据常规成像和生物标志物来评估治疗反应。这种延迟使许多患者暴露于不必要的药物毒性下，并延误其他潜在有效的治疗时机。早期检测对治疗药物的反应对于改善肿瘤患者结局是必不可少的，目前常规监测主要通过检测血液蛋白质生物标志物来进行。ctDNA甲基化检测反映肿瘤负荷变化的特征使其有望成为监测治疗反应的新方法。一些研究报道了在化疗期间多个时间点使用ctDNA甲基化定量来监测肿瘤动态，例如使用血浆中ctDNA甲基化GSTP1来追踪前列腺癌患者对化疗的反应。在35例接受多西他赛或米托蒽醌治疗的探索性患者队列中，首次化疗后2~38个月（中位数15个月）内血浆甲基化GSTP1水平升高，随后前列腺特异性抗原（prostate specificantigen，PSA）水平升高，表明血浆甲基化GSTP1可能是较PSA更好的总生存率预测指标[16]。Fackler等[17]通过全基因组甲基化芯片筛选和TCGA数据缩小范围，最终选择了10个基因的甲基化标志物用以区别乳腺癌和健康对照，然后通过追踪使用多西他赛和伊马替尼或卡培他滨治疗的29例乳腺癌患者血清中上述标志物的甲基化水平，发现治疗1~2周后上述组合甲基化水平降低，患者疾病稳定或部分缓解，无疾病进展。持续追踪观察到在临床疾病进展之前可以检测到ctDNA甲基化水平升高。此外，血清Ras相关区域家族1A（rasassociation domain family 1A，RASSF1A）和维甲酸受体β2（retinoicacid receptor beta 2，RARB2）基因甲基化水平还被发现能指示肺癌治疗反应[18]。
尽管上述研究将ctDNA甲基化降低与肿瘤体积减小相关联，从而评估化疗敏感性，但考虑到血液中ctDNA的半衰期只有2 h，可以提供非常快速的针对肿瘤状态变化的测量，2015年Wang等[19]采取了不同的思路，使用甲基化ctDNA的增加来评估化疗诱导的肿瘤细胞死亡的程度。结果显示24 h内循环甲基化RASSF1A或APC1的增加与完全/部分化疗响应相关，而治疗后两个标志物没有变化与肿瘤稳定/进展相关。这些ctDNA甲基化变化的不同方向可以通过化疗诱导细胞死亡导致ctDNA的初始水平激增来解释。与升高时间相比，化疗后ctDNA甲基化下降时间的范围从1周到1年不等，这些波动强调了对化疗作出反应时详细表征ctDNA动力学的重要性。
3．ctDNA甲基化检测可反映肿瘤的预后、侵袭和复发：
甲基化可以通过沉默调节细胞生长和转移潜能的基因来促进肿瘤进展，还可以反映肿瘤亚型，所以其又与肿瘤预后相关联，许多研究用以指示肿瘤侵袭和复发的可能性。ctDNA甲基化与肿瘤预后的研究中，所选基因在癌症相关过程中功能已知，如细胞增殖，凋亡等，例如胃癌中X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（X-linkedinhibitor of apoptosis protein associated factor 1，XAF1）基因的甲基化与生存率下降有关，手术后甲基化XAF1患者和非甲基化XAF1患者的中位无病生存期分别为23.4个月和39.6个月[20]。性别决定区Y基因盒17（sexdetermining region Ygene box 17，SOX17）基因通过调节WNT信号传导途径发挥抑瘤作用，其表达抑制能够促进肿瘤发生。两组研究报道了血液中SOX17甲基化与食管癌和胃癌的预后不良有关。在40例食管癌患者队列中，使用包括SOX17等在内的8个基因的启动子和外显子1区的9个CpG甲基化探针用于预测预后，发现SOX17是多变量分析中的独立预后因素[21]。在另一组73例胃癌患者队列中，血清SOX17甲基化与肿瘤分化以及总生存期相关[22]。RARB2是一种视黄酸受体，通常发挥抑瘤作用，其甲基化一直被证明与结直肠癌、乳腺癌和肺癌预后不良相关[18]。在胃癌中，RUNT相关转录因子（runt related transcription factor 3，RUNX3）基因术前血清甲基化水平在晚期阶段高于早期阶段，且复发病例术前血清RUNX3甲基化明显高于非复发病例，很可能是由于ctDNA甲基化水平反映了肿瘤负荷。此外，评估血清RUNX3甲基化和CEA可改善对结直肠癌的诊断[23]。
综上，ctDNA甲基化能克服现有肿瘤标志物特异性差，假阳性率高的缺点，在临床应用方面展现出广阔前景。但是，我们也应该意识到ctDNA甲基化检测距离真正进入临床实践还有很长的路要走。主要应注意以下几点：
（1）因为临床试验中抗肿瘤的疗效评价需要长期随访收集完整的治疗信息和预后信息，目前在临床上存在较大困难。ctDNA甲基化检测应注意样本收集的时间点，如治疗前后对比来评估疗效，甚至治疗全程多时间点依次收集样本来监测病程。
（2）ctDNA在血液中半衰期较短，其甲基化动力学变化应纳入考虑。
（3）技术进步使得检测数万个CpG位点成为可能，但是全基因组ctDNA甲基化检测技术对生物信息学提出了更高的要求。
（4）ctDNA甲基化标志物的诊断效能仍需与其他癌症循环生物标志物进行比较。未来ctDNA甲基化检测可用于癌症个体化实时诊治，包括癌症筛查、诊断、疗效监测及预后判断。
E. 目前肿瘤基因检测有哪些
目前肿瘤基因检测主要包括：
一：CTC循环肿瘤细胞检测
癌细胞会从原发肿瘤上脱落，透过血液系统通往身体各处器官。这些在血液中检测到的癌细胞被称为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTC）。由于循环肿瘤细胞往往具有高存活力和扩散能力，所以从血液中侦测CTC的数量，适用于8种常见癌症 (大肠癌, 肺癌, 乳腺癌, 胃癌, 肝癌, 前列腺癌, 食道癌, 鼻咽癌)。可用以癌症早期筛查，如发现CTC，同步检测CTC上PD-L1的表达，用以评估病人是否适合免疫治疗。
二：ctDNA癌症早期基因筛查
ctDNA（circulating tumor DNA）即循环肿瘤DNA，癌细胞不停地生成和死亡，死亡的癌细胞会释放出ctDNA进入血液循环，通过抽取受测者血液肿提取ctDNA进行检测及分析，可一次性全面检测女性常见30种癌症及男性常见27种癌症，在最早期得知罹患癌症的风险状况。与传统的癌症早期筛查（例如PET-CT影像学检测肿瘤大小、肿瘤标记物的检测）相比较，ctDNA癌症早期基因筛查可以提早3-5年就发现癌症，真正地实现在病变发生癌症前就检测出癌症，早发现发预防，大大地降低癌症的发病率和死亡率。
三：遗传性肿瘤基因筛查
基因遗传自父母，如果父母携带有致病基因，下一代罹患癌症的风险将显着增加。
临床研究发现，在所有的癌症患者中，遗传性癌症占比8~10%左右。
因此，了解家族是否携带肿瘤致病突变基因，预估罹患遗传性肿瘤的风险，尽早作针对性性预防，可有效保障个人同家人的健康。可一次性检测18种肿瘤，79种遗传性肿瘤基因。
透过遗传基因测试，可找出求诊者有否可导致癌症的基因突变。如测试结果属阳性，表示求诊者是患癌的高危人士。
F. 科普讲堂 | 关于cfDNA你了解它多少
cfDNA（cell free DNA）指存在于人体血液循环中的、游离于细胞外的高度片段化DNA。在特定情况下（如肿瘤患者、孕妇、接受器官移植的患者等），一小部分来自“异源性”细胞的cfDNA（如肿瘤细胞、胎儿细胞、或供体细胞）可以作为基因检测的标志物。其中死亡的肿瘤细胞破裂后所释放出来的、片段化的基因组 DNA也称之为ctDNA（circulating tumor DNA）。基于cfDNA检测的“液态活检”技术在产前诊断、肿瘤的筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估等多个方面受到极大的关注。
细胞主动裂解（又叫细胞凋亡）过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸，它们的大小基本上在150-200bp左右。人体是一个庞大而复杂的循环系统，其中的运作周而复始，循环往复。除了整个人体的大循环，还有组成人体的各个部件各自的“小循环”，简单来说，就是人体各个器官更换状态的周期。一般情况下，人体会在半年内更新掉身体的98%组织的细胞，也就是说每天每时每刻我们体内都不断地有细胞在凋亡又有新的细胞在形成。
细胞被动裂解——这种裂解的方式就有很多，既可以来源于外界物理或者化学刺激引发的组织坏死，也可以是自身免疫系统对细胞杀伤作用，不同的是这个过程产生的核酸很大，会接近基因组DNA大小。
方法一：酚-氯仿
原理： 利用核酸DNA不溶于有机溶剂的方法将DNA与其他杂质分离
优点： 成本低；设备要求低。
缺点： 操作繁琐；回收率低；抑制物残留多；试剂含有毒成分。
方法二：硅胶柱
原理： 核酸在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高PH值时核酸从硅胶膜上洗脱下来，经过多次离心转管收集
优点： 纯度高；成本较低。
缺点： 需多次高速离心，操作步骤多；负压抽吸，开放式操作，效率低，易形成交叉污染；
吸附柱会出现堵塞现象；回收率低，损失量大，不适合小片段提取；不同试剂保存条件不一致，易丢失。
方法三：磁珠法
原理： 精制的超顺磁纳米硅磁珠在盐溶液条件下特异性吸附血液中的游离核酸，将吸附核酸的磁珠转移至低盐等条件下将其洗脱下来。
优点： 纯度高；回收率高，小片段同样可纯化；可自动化操作。
缺点： 国外进口试剂成本高。
1. 检测cfDNA片段大小
a）利用凝胶电泳检测，但是不能精确检测片段大小；
b）利用qPCR检测, 但只能检测事先选定的位点，并不适合基因组范围的分析；
c）利用电镜检测， 但费时费力，效率低；
d）利用大规模测序平台检测；
2. cfDNA相关的分子检测
利用计算窗口化保护评分（windowedprotectionscore，缩写wps）进行检测，即：片段大小=在基因组里面一个特殊的点内跨越120bp的DNA片段数量-有端点的片段的数量。它和核小体距离有相关性。我们可以根据核小体的距离来推测cfDNA的来源。
3. 检测目的
a）检测cfDNA的大小可以知道它是由哪种细胞死亡机制产生的：～10000bp的cfDNA由细胞坏死产生；140-200bp的cfDNA由细胞凋亡产生；313-798bp的为孕妇cfDNA；
b）检测 cfDNA相关分子信号，比如甲基化，以及核小体距离可以追溯它的组织来源；
c）检测特定序列的cfDNA的种类数量的变化可以判断癌症，以及相关疾病。
血中cfDNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。其具体医学应用大致包括以下方面：
a）用于产前诊断；
b） 用于免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察；
c）用于肿瘤相关分析。
在上述三类应用中，其在肿瘤分析中的价值尤为重要，虽然目前血中cfDNA分析尚未列为临床必需的检测指标，但数以千计的研究论文和大量一期和二期临床试验的数据，有力支持这一新技术在肿瘤防治中的巨大应用价值：
a）肿瘤的早期诊断；
b）肿瘤治疗方案确定；
c）肿瘤疗效观察；
d）肿瘤预后评估；
e）肿瘤转移风险分析；
f）肿瘤复发监测。
魏祎 | 文案
G. ctDNA是什么有什么作用
ctDNA是肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤的DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)
在非小细胞肺癌中的应用
在过去十年中，对非小细胞肺癌（NSCLC）的理解发生了重要的变化。现在证实，NSCLC具有不同的分子亚型。现在医生认为，针对NSCLC的个性化治疗，应该是利用这些分子亚型匹配相对应的靶向疗法。表皮生长因子（EGFR）突变和ALK易位被认为是NSCLC治疗最有效的靶点。但是EGFR和ALK的突变数量是多种多样的，并且我们检测到的突变类型还在不断地增加。因此，现代科学家们利用基于NGS的ctDNA技术，从患者血液中可以获得ROS1，BRAF，KRAS，HER2-，c-MET，RET，PIK3CA，FGFR1和DDR2的突变信息，从而利用这些突变信息为患者选择合适的靶向疗法。
在乳腺癌中ctDNA的监测作用
乳腺癌转移确诊后，患者已经很少能够彻底治愈。但是现在，我们可以利用含有肿瘤染色体异质性的ctDNA来对乳腺癌进行检测。在H Saal教授的研究中，他们对20例早期确诊的原发性乳腺癌患者进行了监测和长期随访。通过NGS和液体数字PCR联合使用的方法，他们能够覆盖很多低信号的全基因组测序结果，并且首次发现，在手术后，ctDNA监测是高度精确的，其成功监测预示了93%的复发病人以及100%的没有复发的病人。基于ctDNA的监测中，转移患者的平均生存期是11个月，而在患者的长期不进展期的时候，是没有检测到ctDNA的。因此，ctDNA能够预测不良生存期。这些发现表明，我们可以利用ctDNA来监测早期乳腺癌患者的转移情况，并帮助修改治疗方案，避免过度治疗。
NGS-ctDNA在胰腺癌中的应用
由于通常的活检技术不能够描述分子特性，因此胰腺癌和胆道癌患者通常缺少个性化的治疗方案。而游离的DNA测序能够帮助这部分人群进行精准医疗。在Eric A. Collisson教授的研究中，他们分析了26名患者肿瘤中的54个基因。除了9名患者测序失败，剩下的17名患者中，90.3%的肿瘤突变都能够在ctDNA中发现。其正确率为97.7%，灵敏度为92.3%，特异性为100%。同时，他们发现，ctDNA与肿瘤标记动态是具有相关性的。因此，可以在胰腺癌和胆道癌患者中，通过ctDNA测序的方法，来确定患者的肿瘤基因型，从而为患者提供准确的靶向疗法。
从基于NGS的ctDNA的临床数据来看，其在转移性肿瘤监测，肿瘤突变类型的检测等方面，都具有高精度，高灵敏度，高特异性的优点。加上该技术的无创性和简便性，其在肿瘤治疗中，将会在肿瘤预后，肿瘤精准疗法等方面，为临床治疗和护理带来一次质的飞跃。在ctDNA研究领域，已经有了很多优秀的公司。上海立迪配备了优秀的研究团队，在进行ctDNA研究及相关产品的开发。 我们相信随着技术的进步，肿瘤的治疗会逐步走向精准化。
DNA 英[ˌdi: en ˈeɪ] 美[ˌdi:en'eɪ]
abbr. 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid); （美国） 国防部核子局(Defense Nuclear Agency);
[例句]DNA fingerprinting has proved the clincher in this investigation
在这次调查中，DNA指纹鉴定起了决定性的作用。
CT
abbr. Connecticut 美国康奈提格州邮递区号;
[例句]We also present results for the classification of solitary pulmonary noles detection and diagnosis using CT images.
同时，给出了该算法应用在孤立肺结节CT图像的检测和诊断中的分类结果。
H. ALK为什么这么“火”(二) | ALK融合基因检测
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ALK融合基因
间变性淋巴瘤激酶（ALK）突变的形式有过量表达、与其他基因形成融合基因，发生点突变等等。
ALK是非小细胞肺癌（NSCLC）常见的一种驱动基因，中国NSCLC突变阳性率5.3%。
ALK融合基因突变主要在肺腺癌里常见，一般肺鳞癌患者ALK融合基因突变概率很低。
有研究说亚裔的EGFR、KRAS野生型的腺癌患者，ALK阳性比例高达30%-42%，因此如果发现EGFR和KRAS是野生型，是更有必要测下ALK基因的。
下图为非小细胞肺癌中ALK的重排形式
01
免疫组化（IHC）
原理：通过抗原和抗体的结合反应，配合信号级联放大来检测。罗氏公司的Ventana IHC 试剂盒可以达到与FISH检测结果94%~100%的一致率。
判读标准是肿瘤细胞胞浆出现簇状黄棕色染色颗粒，胞膜着色则为阴性。欧盟和中国都已经批准Ventana IHC用于检测ALK重排。
缺点：由于肿瘤异质性，靶蛋白的表达强度不均一。由于存在蛋白或RNA降解的可能，FFPE切片存储大于3个月的不建议Ventana IHC检测。
02
荧光原位杂交(FISH)
原理：分离探针的FISH方法，设计红与绿两个探针，分别标记ALK基因的两端，一旦ALK基因发生断裂重排或倒转，红绿信号便出现分离，而没有发生断裂的则呈现为黄色荧光信号。
判读标准为单个视野中计数50个肿瘤细胞，>50%的细胞出现分离信号则判读为阳性，如<10%细胞出现分离信号则判读为阴性。如果10%~50%的细胞出现分离信号，则再次挑选50个肿瘤细胞，看计数100个细胞，是否有>15%的细胞出现分离信号（仅限用于雅培的分离探针试剂盒）。
缺点：无法判断ALK的融合型，必须由经验丰富的病理科医师来完成。15%的临界值存在一定争议，由于肿瘤异质性、取样偏差等问题，存在假阴性的可能。即漏检ALK突变阳性患者。
03
反转录PCR（RT-PCR）
原理：通过预先设计好的引物对样本的RNA进行逆转录来检测融合突变，简便可行，并可以确定ALK的融合型。
缺点：需要高质量的ALK RNA样本，临床大部分是石蜡样本，RNA降解严重，影响检出率，导致假阴性的结果，大于2年的标本不建议使用RT-PCR检测，推荐新鲜肿瘤组织样本。通过PCR引物只能检测已知的融合基因型，无法囊括所有的融合型。
03
二代测序（NGS）
目前已经证实使用二代测序技术检测基因扩增、基因重排是可行的，而且二代测序有助于发现ALK新的融合突变形式。而且仅需要少量样本即可检测多种基因的突变情况。
缺点：价格较高，判读标准及后续验证等亟待解决。
临床常用的三种方法是FISH、Ventana IHC及RT-PCR，三种方法FISH的灵敏度最低。因此，如果是胸腔积液、细针穿刺取到的细胞学样本做成的蜡块，不建议使用FISH，避免假阴性。另外通过抽血检测循环肿瘤DNA（ctDNA），循环肿瘤细胞（CTC）也正在发展起来。总之在面对ALK检测结果模棱两可的时候，一定要换一个检测方法去验证，也没有哪一种方法灵敏度和特异性都是100%。
参考资料：
DOI: 10.20892/j.issn.2095-3941.2017.0017
，侵删。
I. Oseq-ctDNA肿瘤基因检测的检测内容有哪些
Oseq-ctDNA肿瘤基因检测可以一次性检测肿瘤相关508个基因的全外显子区域，全面、准确解读88种肿瘤药物（未来将持续更新药物种类）与基因的关系，不存在获取肿瘤组织随机性高、检测基因单一、位点不全面等常见问题，扩大靶向药物可选择范围，减少患者耐药性产生，提高用药精准性和治疗效率。同时Oseq-ctDNA还为患者提供肿瘤遗传易感基因检测，为患者及家族成员提示遗传性肿瘤罹患风险。