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沙门氏检测方法

发布时间:2022-12-31 07:12:13

1. 如何实现快速检测及有效控制沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠杆菌, 也是肠杆菌科中最主要的食源性致病菌。据有关资料统计由沙门氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所占比例已超过三分之二,2007年发生的“ 花生酱事件”以及 2008 年发生的“ 西红柿 事件”等[1]沙门氏菌中毒事件的发生也使得食品中沙门氏菌的检测受到人们的普遍关注。本文主要是对食品中沙门氏菌的传统检测方法以及后续建立的以分子生物学、免疫学、生物传感器和电化学为基础的快速检测方法进行了系统的综述,旨在为该致病菌的检测方法的研究应用提供一定的参考。
1、 传统的检测方法(国标法)
目前, 我国对食品中沙门氏菌的检测大多采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品样品进行检测,这种传统的培养方法可分为前增菌、增菌、分离培养、生化试验和血清学鉴定等步骤进行。虽然传统培养法可靠性高,但是其操作繁琐且耗时费力,并不能满足食品快速检测的要求。
2、分子生物学检测方法
2.1聚合酶链反应技术
PCR技术是一项敏感性高、特异性强且快速准确的微生物检测技术,也被许多学者用于对食品中沙门氏菌进行检测和研究。汪琦等[2]就采用传统培养方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 种方法对沙门氏菌进行检测。在常规PCR的基础上宋东晓[3]建立了检测食品中沙门氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技术也运用于食品中沙门氏菌的检测,钟伟军[4]通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法,此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
2.2核酸探针技术
核酸探针技术是根据核苷酸碱基互补的原理,在已变异的DNA样品中加入用同位素等标记的DNA特异片段,在一定条件下两片段进行杂交从而达到检测DNA的目的。此技术不仅简便、快速而且敏感性高、特异性强,已用于食品中沙门氏菌的检测。Almeida等[5]通过建立一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中沙门氏菌进行了检测,准确度高达 100%。
2.3基因芯片技术
基因芯片技术是利用已知核酸序列的探针与靶核苷酸序列杂交,然后通过信号检测对其进行定性与定量分析,在沙门氏菌等各种致病菌的分析检测中有很好的应用前景。饶宝等[6]通过建立检测致病菌的基因芯片检测方法,设计了通用引物和特异性探针: 沙门氏菌探针、大肠杆菌探针和金黄色葡萄球菌探针,实现了同时检测并区分沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的目的。祝儒刚等[7]运用多重 PCR 结合基因芯片技术建立了检测肉及肉制品中的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌等5种食源性致病菌的快速检验方法。
2.4噬菌体裂解技术
噬菌体有特异性裂解细菌的作用。张碧波等学者利用此技术进行沙门氏菌
快速检测,结果和其他学者相同,据此得出特异性噬菌体可以检测出沙门氏菌,此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌体裂解对150份食品样品进行快速检测,结果说明肠杆菌科噬菌体组合对培养10h的沙门氏菌敏感性和特异性较高,这对实现沙门氏菌实时、快速而准确的检测有重要意义。
2.5环介导等温扩增技术(LAMP)
环介导等温扩增技术是2000年Notomi等开发的一种新的恒温核酸扩增方法,此方法的特点是特异性强、灵敏度高且简单、快速,适合对大规模样品的快速检测[9]。李佳桐[10]通过实验建立了沙门氏菌的LAMP检测方法,并将此方法与常规PCR进行比较,结果显示:LAMP方法对沙门氏菌的检测恒温65℃下只需要40min,只扩增沙门氏菌,不会扩增其他革兰氏阴性菌,最低可检出浓度10cfu/mL,比常规PCR的最低检出浓度高1个数量级,通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,能够快速简便的观察检测出绿色的阳性结果十分明显的区别于橙色的阴性结果。
3、免疫学方法
3.1酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附法简称 ELISA, ,此技术敏感性高 ,不需特殊设备 ,结果观察简便,早在1977年就有报道将酶联免疫吸附法用于食品中沙门氏菌的检测。伍燕华等[11]设计捕获抗体和检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法对食品中的沙门氏菌进行检测。张帅等[12]建立双抗夹心ELISA体系,检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800CFU/g,等均并与其他血清型沙门氏菌、单增李斯特菌等菌均无交叉反应,特异性良好。
3.2免疫荧光标记技术
免疫荧光标记技术是根据抗原抗体的特异性反应,将荧光素标记在已知抗原(或抗体)上,与特异抗体(或抗原)结合后产生荧光,可用来定位抗原或抗体、并通过定量分析,确定测定含量。叶明强[13]基于纳米免疫磁珠富集,免疫量子点标记,建立了一种食品中沙门氏菌的含量进行快速检测的方法,研究出了一种新型的免疫荧光食源性致病菌检测技术。
3.3斑点免疫金渗滤法
免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物结合免疫原理的一种应用于抗原抗体的新型技术,该技术运用最广泛的就是斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。孔繁德等及曹春梅等都利用此技术对沙门氏菌的快速检测进行了研究,曹春梅等[14]是利用斑点免疫金渗滤法对沙门氏菌O9抗原进行了研究,结果表明此法简单、快速,适合推广运用;孔繁德等[15]是通过建立直接检测沙门氏菌的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒对该菌进行了研究。
3.4免疫磁性分离技术
免疫磁珠分离技术是将特定病原体的单抗或多抗与磁珠微球偶联,并通过抗原抗体反应形成磁珠,在外加磁场作用下磁珠会发生定向移动,从而达到分离目标病原体的作用。食品样品中致病菌含量很少,常规的方法是很难从中分离出来的,借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。王海明等[16]应用磁免疫技术建立快速检测食源性沙门氏菌的方法,结果表明此方法能对食品基质中的目标菌进行快速有效的富集,其检测限<10cfu/25g,检测周期约为40小时。胡霏[17]也通过实验针对鼠伤寒沙门氏菌建立免疫磁分离技术结合荧光层析技术的快速检测方法。
4、生物传感器技术
生物传感器是利用一些生物活性物质如酶 、多酶体系 、抗体等做为敏感器件,然后配以适当的信号传导器所构成的分析检测的工具。我国学者已采用此法对沙门氏菌的抗原、抗体的免疫吸附进行检测,并已用于快速检测食品中致病的沙门氏菌,而仅需 1h 完成,达到了快速的检测目的。宁毅[18]在对碳纳米管性质研究的基础上,结合分子探针构建了碳纳米管生物传感器,并将其用于沙门氏菌的检测,结果显示所构建的传感器灵敏度高、特异性强、稳定性好。
5、电阻抗技术
电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术,因为具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点,目前此法已用于食品中沙门氏菌检测检验并已通过美国公职分析化学协会(AOAC)认可。陈广全等[19]建立了电阻抗法快速检测食品中沙门氏菌的方法,并将其与常规培养法进行比较,对食品中的沙门氏菌属进行检测,结果表明电阻抗法比传统培养法更加快速、可靠。
6、总结
综上所述,沙门氏菌检验技术正从传统的培养方法向分子检测方法改进,并向仪器化、标准化、自动化方向发展,并且食品安全、致病菌等问题对人类健康以及生活环境都造成了严重威胁,加强沙门氏菌检测势在必行。目前沙门氏菌快速检测技术大多具有检测迅速、灵敏度高、特异性强等特点,此外这些方法还具有各自的优点和局限性,在未来发展过程中需要我们不断改进和创新,建立更成熟可靠、方便快捷的沙门氏菌快速检测技术。

2. 沙门菌的实验室诊断程序是什么

实验室检验程序如下:
1。检验程序
直接镜检 p-标本采取与处理一增菌培养被检材料血清学检查(凝集反应等)
2。检验方法
(1)标本采取与处理可采取粪尿、血液、水源、禽蛋、食 品等作为标本送检。采取标本如在疾病后期或用过抗菌药物 之后,粪中沙门氏菌的含量锐减,需用增菌培养基(一般用
0。
5%亚硒酸盐肉汤)接种1克左右的粪便,37℃过夜后再分 离。尿经离心沉淀后,取沉淀物直接分离或予以增菌法同 粪便。食物和食物中毒标本经用前增菌或选择性增菌,再分 离培养。对血清学试验呈阳性的家禽或其他被检禽须先作剖 检,取脏器、心血、心包液、卵巢和输卵管或其他病变组织,直 接在S。
S或麦康凯琼脂平板上,涂布分离培养。
(2)直接镜检标本直接涂片染色镜检,沙门氏菌为革 兰氏染色阴性、无夹膜和鞭毛、有菌毛的直杆状菌。大多数细 菌为周毛菌,具有活泼运动性,但鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙 门氏菌恒定地无运动力。
(3)分离培养为了提高阳性检出率和血清学鉴定时减 少诱导手续,应进行增菌或选择性增菌。
同血清型沙门氏菌 在各种选择性增菌培养中的生长能力并不一致,可用几种选 择性增菌方法。分离沙门氏菌一般常用琼脂,但亚硫酸 铋琼脂(BSA)的分离率高于S。 S琼脂。但BSA不适宜于分但必须与当地致病型对口,效果才好。致病性大肠杆菌,大多 能合成K88ab或K88'这种细胞壁抗原包被在大肠杆菌表面, 使大肠杆菌粘附于小肠黏膜引起下痢。
致病性大肠杆菌还能产生L℃毒素(不耐热)、S℃毒素 (能耐热)和溶血毒素(能引发仔猪水肿病或黄痢,死亡率可 高达100%)。日本曾因0157型大肠杆菌造成人的严重腹泻 症。仔猪白痢主要发生于7 ~30日龄仔猪,多由08、1<88或 060、0„5等血清型大肠杆菌引起。
犊白痢主要发生于10日龄 以内犊牛。大肠杆菌、类大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌均可 致病,分肠型、败血型、肠毒血型三型。羔羊3 ~8周易患“羔 羊大肠杆菌病”,冬、春多发,由那波里大肠杆菌引起。
幼禽(鸡、鸭、鹅、火鸡、肉鸽)都能发病,作为肠道中的常 在菌,还能通过种蛋传染。
以2 ~4周龄最易感。各种应激因 素如卫生不良,饲养管理不当,气候突变,营养缺乏,禽舍潮 湿、拥挤或其他传染病(法氏囊炎、鸡新城疫)爆发时,易诱发 大肠杆菌病。

3. 关于沙门氏菌的检测

沙门氏菌属肠道细菌科,包括那些引起食物中毒、导致肠胃炎、伤寒和副伤寒的细菌。能引起食物传播性疾病,近年来,已经成为最常见的食物中毒原因。肠炎沙门氏菌感染通常源于奶制品、禽产品和肉产品;鸡肉和鸡蛋尤其是高风险食品。沙门氏菌感染的症状通常是肠胃出现问题,包括恶心、腹部绞痛、呕吐和腹泻,一般最多持续7天。在免疫力低下的人群中,如果不及时服用抗生素类药品,沙门氏菌感染将导致生命危险。沙门氏菌测试片(FilmplateTM Salmonella BS205)含有选择性培养基、沙门氏菌特有辛酯酶的显色指示剂和高分子吸水凝胶,运用微生物测试片专有技术,做成一次性快速检验产品,一步培养15~24h就可确认是否带有沙门氏菌,非常适合各级检验部门和食品企业使用。本产品适用于肉和肉产品、蛋及蛋制品、冷饮等的快速检测。

三方圆沙门氏菌测试片操作方法:
1、样品处理:取样品25mL(g)放入含有225mL灭菌磷酸缓冲液稀释液(或生理盐水)的取样罐或均质杯内,制成1:10的样品匀液。
2、接种:将沙门氏菌测试片(BS205)置于平坦实验台面,揭开上层膜,用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上,然后再将上层膜缓慢盖下,静置10s左右,使培养基凝固,每个样品接种两片。同时做一片空白阴性对照。
3、培养: 将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口。透明面朝上水平置于恒温培养箱内,堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃,培养15~24h。

结果判读:
对测试片进行观察,呈紫红色的菌落为沙门氏菌;呈蓝色的菌落为其他菌群。出现阳性菌落的样本,最好用其他更为可靠的方法进行验证,没有条件的至少要再取样重复检验一次。

4. 美正生物的沙门氏菌血清型分子鉴定试剂盒的检测步骤

美正生物的沙门氏菌血清型分子鉴定试剂盒的检测步骤:
1、核酸提取
加热法:刮取至少10个菌落,悬浮于100μL的无菌水中,漩涡震荡10s(如果菌落未能均匀分散,可适当延长震荡时间),95℃或沸水浴5min,冷却至室温,12000rpm离心5min,吸取上清。
试剂盒法:可使用商品化的试剂盒提取沙门氏菌的基因组DNA。
2、反应体系配置
从试剂盒中取出预混液,充分融化,涡旋后短暂离心,取22.5μL置于PCR管或PCR板中,然后各取模板2.5μL分别加入PCR管或PCR板中(每种模板要使用十二种预混液),盖好管盖或板膜,短暂离心,立即进行PCR扩增反应。
3、PCR扩增
PCR管或PCR板置于PCR仪上,推荐反应程序设定如下:反应体系为25μL,在第二步每个循环60℃时检测荧光信号,检测通道选择FAM、HEX(VIC)、CY5。

5. 沙门氏菌的检测标准

太多,DB标准设有列出,只列了国标和部分部标
GB/T 13091-2018 饲料中沙门氏菌的测定
GB/T 14926.1-2001 实验动物 沙门菌检测方法
GB/T 17999.8-2008 SPF鸡 微生物学监测 第8部分:SPF鸡 鸡白痢沙门氏菌检验
GB/T 22429-2008 食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 酶联免疫法
GB/T 28642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法
GB 4789.31-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验
GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
GSB 11-2275-2017 奶粉中沙门氏菌定性标准样品
GSB 11-3354-2016 肠沙门氏菌肠亚种标准样品
NY/T 550-2002 动物和动物产品沙门氏菌检测方法
SN/T 1059.6-2016 出口食品中沙门氏菌属检测方法 第6部分:垂直膜过滤法
SN/T 1059.7-2010 进出口食品中沙门氏菌检测方法 实时荧光PCR法
SN/T 1169-2002 猴沙门氏菌检验操作规程
SN/T 1382-2011 马流产沙门氏菌凝集试验方法
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6. PCR法检测沙门氏菌的操作过程

首先你要有检测沙门氏菌的特异性引物!
然后将PCR的各个组分混合到一起,根据引物调整好退火温度和延伸时间25-30个循环后电泳看结果

7. 沙门氏菌快速检测

用沙门氏菌显色培养基,检测原理:蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;胆盐抑制革兰氏阳性菌;选择性添加剂增强培养基的抑制杂菌的能力;混合色素分别与沙门氏菌和大肠菌群所对应的酶发生特异性反应,水解底物,释放出显色基团,在淡黄色平板上沙门氏菌产生品红色的菌落。资料来自环凯官网,可以上去具体了解一下。

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