鼠疫PCR检测方法

1. 鼠疫耶尔森菌的微生物学检查法

用DNA探针杂交方法或PCR技术检测鼠疫耶尔森菌核酸，有助于鼠疫的诊断。PCR敏感性极高，蚤体内有10个鼠疫耶尔森菌感染即可用PCR技术检出。

2. 鼠疫杆菌的检测

鼠疫杆菌的检验必须严格执行烈性菌管理规则，注意防止气溶胶感染或防蚤叮咬。动物实验应有防护设备，实验用过培养物及器材应及时消毒。取检材涂片，用甲醇或酒精乙醚混合液固定5～10分钟，然后进行革氏或美兰染色，镜检观察鼠疫杆菌的形态特征。将检材划线接种于普通琼脂平板上，龙胆紫血琼脂平板及厚金格尔（hottinger）琼脂平板上。28℃孵育48小时后观察菌落特征，挑取可疑菌落，涂片、染色、镜检。必要时，接种厚金格尔斜面和肉汤，作噬菌体裂解、凝集或沉淀试验等进一步鉴定。确诊第一例鼠疫报告时，须作豚鼠皮下或擦皮接种试验。

3. PCR产物的检测方法有哪些都有什么原理

1.琼脂糖凝胶电泳 同时点分子量marker，根据marker条带判断产物分子量大小，从而大致判断是不是你要的
2.酶切 已知你产物的序列，看上面有什么酶切位点，用一个酶或者两个酶切断，看与理论预测的条带数目和大小是否一致。一般检测有以上两步就行了，如果需要知道确切的需要进行3
3.测序 连接到pMD-18t 载体上，转到大肠杆菌中。拿到公司去测序，测序结果通过gene bank比对看与哪个基因一致，这种方法最准确
4.表达 pcr产物连到真核或者原核表达载体上，适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析，看与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段

4. 怎么检查自己得了鼠疫

突然出现发热、寒战、淋巴结疼痛、咳嗽、咳血或出血等任一症状，应当立即就医，可以通过检查血常规、细菌的分离和鉴别、血清学检查、聚合酶链反应（PCR）检测等方式，确认是否得了鼠疫。

临床表现：

1、潜伏期

腺型2～8天；肺型数小时至2～3天；曾经预防接种者可延至9～12天。

2、症状体征

1）轻型

有不规则低热，全身症状轻微，局部淋巴结肿痛，偶可化脓，无出血现象，多见于流行初、末期或预防接种者。

2）腺型

多见，常发生于流行初期。急起寒战、高热、头痛、乏力、全身酸痛偶有恶心、呕吐、烦躁不安、皮肤淤斑、出血。发病时即可见蚤叮咬处引流区淋巴结肿痛，发展迅速，第2～4天达高峰。腹股沟淋巴结常受累，其次为腋下、颈部及颌下。

由于淋巴结及周围组织炎症剧烈，使呈强迫体位。如不及时治疗，肿大的淋巴结迅速化脓、破溃、于3～5天内因严重毒血症、继发肺炎或败血症死亡。治疗及时或病情轻缓者腺肿逐渐消散或伤口愈合而康复。

二、预防措施

1、管理传染源

加强国际检疫，防止从国外传入。发现疑似或确诊患者即予分别隔离，并于 6h 内向卫生防疫机构报告，接触者检疫 6 天。

肺鼠疫隔离至痰培养 6 次阴性，腺鼠疫隔离至淋巴结肿完全消散后再观察 7 天。患者排泄物及用具应彻底消毒或焚毁。疫区封锁至少 9 天，大力开展捕鼠、灭鼠、消灭其他疫源动物，控制鼠间鼠疫。

2、切断传播途径

1）消灭跳蚤患者的身上及衣物都要喷撒安全有效的杀虫剂杀灭跳蚤，灭蚤必须彻底，对猫、狗，家畜等也要喷药。

2）加强交通及国镜检疫对来自疫源地的外国船只、车辆、飞机等均应进行严格的国境卫生检疫，实施灭鼠、灭蚤消毒，对乘客进行隔离留检。

5. PCR检测的具体步骤是什么

具体步骤就是：
1，制备琼脂糖凝胶，或者聚丙烯酰胺凝胶
2，取少量（大概5ul）PCR产物（确定是否加入上样缓冲液），点样到凝胶孔里，记得点合适的maker
3，接通电源，调好电压（120V）,开始运行
3，等跑到大概2/3处，在紫外成像仪里查看条带。
就是如此，关键看你设备是否齐全

6. 高中生物。RT-PCR怎样检测病毒含量呢

RT-PCR检测方法的具体步骤如下：
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计： 检测标本RNA
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。） 阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液） 1）按下表加入试剂： PCR反应体系
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增。
4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。 4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。 5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断。

7. 鼠疫的检查

1.常规检查
白细胞总数及中性粒细胞增多，红细胞与血红蛋白减少则因出血程度而异，血小板可减少。肠炎型者可有血样或黏液血便。
2.细菌的分离和鉴别
取血、脓、痰、脑脊液、淋巴结穿刺液等材料送检。一般检查程序包括显微镜检查、培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物实验，简称四步试验，以上四步均获阳性结果可确诊鼠疫。
3.血清学检查
（1）荧光抗体染色镜检（IFA）具有快速、敏感度及特异性较高的优点，但有假阳性或假阴性。
（2）间接血凝反应（IHA）是将鼠疫特异性抗原（或抗体）致敏的红细胞与被检材料混合，用于检查和测定鼠疫抗体（或抗原）。是一种快速、敏感、特异性高的血清学诊断方法。不仅可检查活菌和死菌，也可检查可溶性抗原以及污染、腐败的材料。70年代于我国得到普遍推广，是目前行之有效的快速诊断方法之一。
（3）放射免疫沉淀试验（RIP）敏感、高度特异，不仅是目前鼠疫监测、查源较为理想的方法之一，特别是轻型和不典型病例的追索诊断，作为补充IHA的不足，具有一定的实用价值。
（4）葡萄球菌A蛋白的血凝改进方法（SPA-IHA）比间接血凝的检出率高，方法更简便，适于野外基础实验使用。
4.聚合酶链反应（PCR）检测
可以在几小时内作出诊断，是一种快速和高度特异的方法。对鼠疫监测、临床早期诊断及分子流行病学调查有重要意义。
5.其他的检测方法有ELISA法及放射免疫法等

8. PCR产物的检测方法有哪些都有什么原理

1.琼脂糖凝胶电泳 同时点分子量marker,根据marker条带判断产物分子量大小,从而大致判断是不是你要的
2.酶切 已知你产物的序列,看上面有什么酶切位点,用一个酶或者两个酶切断,看与理论预测的条带数目和大小是否一致.一般检测有以上两步就行了,如果需要知道确切的需要进行3
3.测序 连接到pMD-18t 载体上,转到大肠杆菌中.拿到公司去测序,测序结果通过gene bank比对看与哪个基因一致,这种方法最准确
4.表达 pcr产物连到真核或者原核表达载体上,适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析,看与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段

9. 微生物学的检查方法是有哪些

微生物学检查法

标本

因鼠疫传染性极强，采集标本时必须严格无菌操作。根据病型采取淋巴结穿刺液、肿胀部位组织液、脓汁，血液和痰等。人和动物尸体可取肝、脾、肺、病变淋巴结以及心血等。陈旧尸体取骨髓。将采集标本送至有严密防护措施的专门实验室进行检查，禁止在一般实验室进行操作。

直接涂片镜检

除血液标本外，一般均需涂片或印片，干燥后用甲醇固定，革兰染色或吕氏美兰染色，镜检。在不同材料中，菌体大小、形态有很大差异，除典型形态外，往往可见菌体呈多形态性，需加以注意。

分离培养与鉴定

血液标本需先置肉汤中进行增菌培养。分离培养一般选用血琼脂平板，28摄氏度24小时后，可见较小的露滴状菌落，继续培养则菌落增大至1～2毫米，中央厚而致密，周边逐渐变薄。取可疑菌落进行涂片染色镜检，噬菌体裂解试验，血清凝集试验，特异荧光抗体染色等作出鉴订。

血清学试验

可用于检查鼠疫耶尔森菌抗原或特异性抗体。敏感而特异的试验方法有ELISA、固相放射免疫分析，SPA协同凝集试验等。

检测核酸

用DNA探针杂交方法或PCR技术检测鼠疫耶尔森菌核酸，有助于鼠疫的诊断。PCR敏感性极高，蚤体内有10个鼠疫耶尔森菌感染即可用PCR技术检出。

诊断检查

诊断：取决于病人有接触史及肺部受累表现，病因诊断取决于痰、血或淋巴结吸出物革兰染色、培养，有条件的单位可作直接荧光素标记抗体染色，可提供快速的病因诊断。

10. 怎样确定得了鼠疫

如果突然出现发热、寒战、淋巴结疼痛、咳嗽、咳血或出血等任一症状，应当立即就医，可以通过检查血常规、细菌的分离和鉴别、血清学检查、聚合酶链反应（PCR）检测等方式，确认是否得了鼠疫。

一、鼠疫的临床表现

主要的临床类型包括腺鼠疫、肺鼠疫和败血型鼠疫，其他类型鼠疫如皮肤鼠疫、肠鼠疫、扁桃体鼠疫等型比较少见。

1、腺鼠疫

临床表现主要是高热、畏寒、伴恶心呕吐、头痛及四肢痛、颜面潮红、结膜充血、皮肤黏膜出血点等。多表现为腹股沟淋巴结、腋下淋巴结和颈部淋巴结肿大，且发展迅速，多为单侧，一周后淋巴结很快化脓破溃。

(10)鼠疫PCR检测方法扩展阅读

一、鼠疫的危害

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性疾病，通常在啮齿动物之间流行，偶尔能引起人间流行，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病。北京不属于鼠疫自然疫源地，但依然存在鼠疫输入和传播的风险。

鼠疫起病急、病程短、死亡率高、传染性强、传播迅速。特别是败血性鼠疫和肺鼠疫，如果不加治疗，病死率为30%-100%。鼠疫潜伏期较短，一般为1-6天，但个别病例可达8-9天。

二、鼠疫的传播

1、蚤叮咬的传播方式

鼠-蚤-人，即跳蚤叮咬病鼠后再叮咬人，或剥取染疫旱獭皮或剥食其它染疫动物，此类传播方式常引起腺鼠疫或败血型鼠疫。

2、人-人传播方式

即健康者接触患有肺鼠疫的病人后，经呼吸道吸入感染，此种方式感染的主要为肺鼠疫。

三、预防办法

1、减少疫区活动区域

避免到疫区旅游或活动，避免接触啮齿动物(如：鼠类、旱獭)。

2、避免与患有鼠疫的病人密切接触

与可能感染肺鼠疫的病人接触时，尽量和病人保持1米以上的接触距离，并戴口罩，勤洗手。

3、采取防虫措施

采取必要的防跳蚤叮咬措施，使用驱虫制剂，常用驱蚊剂一般都可以驱赶跳蚤。