⑴ 细胞活性检测的方法有多少种 每种的原理是什么
简单说几个把
染色体法 主要在培养基中利用死活细胞对燃料亲和力不同 来判断
克隆形成实验 原理是单个细胞在体外增至六代后，后代形成的细胞群体 ，通过计算其克隆形成率 来判断
比色法 也是比较经典的 M,RR 活体细胞中的线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将M，rr还原成蓝紫色的结晶甲醋 死细胞无此功能
⑵ 鉴定培养细胞活力有多种方法，fda是主要方法之一，其原理是什么
细胞活力鉴定的方法：
1、相差显微镜观察法 2、FDA染色法 3、伊凡蓝染色法
FDA染色法：是测定原生质体活性的一种方法，即荧光素双醋酸酯染色，FDA本身无荧光，
进入原生质体后便产生荧光素，它不能自由进入原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荧光。
原生质分离，酶，纤维素酶，离析酶。
步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原
生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次
→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。
原生质体的培养：
培养基，MS+NAA 2.0ppm+BA 0.5ppm+3%蔗糖+9%甘露醇
注意：
1、原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。
2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。
影响原生质体培养的因素，营养需求（NH4+不能过多）渗压剂，培养密度（105/mL）
贮藏条件（通常在黑暗处）。
培养方法:液体基质培养法,半液体基质培养法,固体基质培养法,看护培养。
固体培养的步骤,原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖
(40℃)的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细
胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养,培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱
导分化成植物的根茎。
原生质体分离培养的意义：
1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。
2、原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。
3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
取洗涤过的原生质体悬浮液 0.5ml置于10×100mm的小试管中，加入 FDA溶液使其最终浓度为 0.01混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。
⑶ 细胞活性检测的方法有多少种 每种的原理是什么
在目前的细胞活性检测方法中，MTT法是较早且较为经典的方法。但是，由于MTT法形成的甲物是非水溶性的，需要加有机溶剂溶解，这不仅增加了研究人员的工作量，也给实验带来了一定的误差。在这里我们向大家介绍一种国外最新检测方法—CCK-8法，它具有方便、灵敏、快速、无放射性、重复性好的特点。现在已广泛用于细胞增殖检测、细胞毒性检测、药物筛选、药敏试验等。
另外还将向大家介绍几种氧化应激和蛋白质抗体标记的新方法。
内容：
1、新型细胞活性检测方法介绍
2、国外氧化应激测定方法介绍
3、蛋白质抗体标记的新方法介绍
原理恕在下不知
⑷ 对于ALP水解底物测定有哪些方法
一、血清碱性磷酸酶（ALP）测定的常用方法有几种，它们之间有何差别？
正常成人血清ALP主要来自肝脏，而来自骨组织的ALP一般少于总活性一半。其各自含量与年龄密切相 关，但也受性别的影响。还可能存在少量的小肠型ALP，特别是血型为分泌型B型或O型的人。 现已知人体含4型ALP同工酶，即肠型（IALP）、胎盘型（PALP）、生殖细胞型（GALP）和非特异组织型（TUALP）ALP。其中非特异组织型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。
[临床意义] 肝胆疾病，尤其是阻塞性黄疸患者，该酶活性显着升高。骨骼疾病时血清ALP活性增高。血清ALP活性测定成为鉴别肝胆疾病和诊断骨质增生不可缺少的指标。 [测定原理] 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在405nm测定对硝基苯酚生成 的速率，这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。 [常用测定方法] 测定ALP活性受到组织来源、底物类型、反应温度，特别是缓冲液种类的影响，目前，国际上生化试剂主要生产厂家，生产的ALP检测试剂盒的主要差异就在于所使用的缓冲液不同。常用的激活型缓冲液不仅起缓冲作用，并可作为磷酸的受体参与反应，因而能增进酶促反应的速率。激活型缓冲液中，二乙醇胺（DEA）的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）的激活作用更强。因此用不同缓冲液测定的ALP活性，其参考值不同。 不少国家，包括我国，多采用AMP或DEA做缓冲液，但这两类物质不易提纯，前者常混有5-氨基-3-吖-2, 2,5-三甲基乙醇，后者易含一乙醇胺，均对ALP有抑制作用。故日本学者建议采用2-乙氨基乙醇缓冲液，而德国学者建议使用甲基葡萄糖胺缓冲液，此类试剂纯度高，不含抑制ALP活性的物质，可不加螯合剂，其pK值高于DEA。
根据所使用的激活型缓冲液不同，目前常用的检测方法主要有四种： 1、 IFCC推荐方法：AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）缓冲液 正常参考范围：45~130 U/L，37℃ 2、 JSCC推荐方法：EAE（2-乙氨基乙醇）缓冲液 正常参考范围：115~359 U/L，37℃ 3、 GSCC推荐方法：DEA（二乙醇胺）缓冲液 正常参考范围：80~260 U/L，37℃ 4、 DSKG推荐方法（新GSCC方法）：MEG（N-甲基-D-葡萄糖胺）缓冲液 正常参考范围：45~130 U/L，37℃
二、甘油三酯（TG）常用测定酶法中，为什么采用推荐方法—去除游离甘油的二步酶法优于一步酶法？
血脂异常是动脉粥样硬化性疾病的重要危险因素之一，甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、高密度与低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C与LDL-C）是四项基本指标。临床上制定四项血脂的合适水平或异常水平的划分标准、治疗指针及治疗目标，必须在血脂测定结果准确性的基础上进行。由于TG的脂肪酸组成复杂，而且血中还有游离甘油与不完全甘油酯，使TG测定的结果的准确性显得尤其重要。TG测定的常规方法，国内普遍采用甘油磷酸氧化酶法，也是检验学会的推荐方法，但目前因为商品试剂大都未用二步酶法去除游离甘油，这对多数住院病人是不合适的。 [测定原理] 标本中的游离甘油经第1试剂中甘油激酶（GK）作用，最后生成过氧化氢，再经过氧化氢酶分解成H2O，使游离甘油的影响被消除；另外，维生素C由维生素C氧化酶去除。第2试剂中TG等经脂蛋白脂酶（LPL）等作用所产生的过氧化氢，在POD的作用下，使4-氨基安替比林（4-AA）与HDAOS发生氧化缩合，生成紫色的醌色素，通过测定该色素的增加，求出TG浓度。
以SYSMEX公司生产的二步酶法TG测定试剂盒为例：
第一步反应： 抗坏血酸 + 1/2O2 AOD 脱氢抗坏血酸 + H2O 游离甘油 + ATP GK 3-磷酸甘油 + ADP 3-磷酸甘油 + O2 GPO 磷酸二羟丙酮 + H2O2 H2O2 过氧化氢酶 H2O + 1/2O2 第二步反应： 甘油三酯 + 3H2O LPL 甘油 + 3分子游离脂肪酸 甘油 + ATP GK 3-磷酸甘油 + ADP 3-磷酸甘油 + O2 GPO磷酸二羟丙酮 + H2O2 2H2O2 + 4-AA + HDAOS POD 醌类染料 [参考值 ] 高甘油三酯血症： 1.69mmol/L以上（150mg/dL以上）。
[说明] 现阶段允许一步酶法与两步酶法并存，要求逐步过渡到统一采用两步法。在未统一方法前，实验室报告TG测定结果时应注明“去FG值”或“未去FG值”，这将有助于临床医生对结果的正确判断。 正常人血清FG浓度平均约0.11mmol/L(10mg/dl)，在糖尿病、服用含甘油的药物、静脉营养、情绪应急、血标本污染时，FG将明显增高，以致影响对TG水平的判断。 国外学者建议：临床实验室应备有可以去FG空白的试剂，供必要时采用；糖尿病及特殊门诊以及TG>2.3mmol/L者，最好作FG空白校正。
⑸ 谁能告诉我，怎样用对-硝基苯磷酸盐（即PNPP）法测定碱性磷酸酶（ALP）活性
【步骤】
（1）用吸管吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液。
（2）每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.
（3）样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L).
ALP标准曲线绘制:
取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为320umol/L.依次稀释到160 umol/L，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.
【结果】测定碱性磷酸酶的含量
还有其他方法来测定，比如
以ALP为目标物的检测方法有
1 Gomori钙钴法
2偶氮偶联法
3碱性磷酸酶染色试剂盒法。
4.PNPP偶氮法
5. BCIP/NBT比色法
6 茜素红法
7. von Kossa法
⑹ 细胞活性和细胞毒性检测的实验方法
细胞数量确定
1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。
2.向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。
细胞增殖和细胞毒性测定
1.将种子细胞以103-104个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养。将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。
2.将不同浓度的待测物质加入板中。
3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。
4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
6.在读取孔板之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。
7.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。
数据分析
统计分析有几种方法，您可以选择使用O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。
细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。
Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。
Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。
制作标准曲线
1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。
2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）
3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100 μl培养基加入10 μl CCK-8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。
可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。
注意事项
1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。
2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。
3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。
4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。
5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。
6. 孵育2小时后，背景O.D.值一般为0.1-0.2单位。
7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值。
8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用0.2 μm的膜过滤溶液。
9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达4小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。
10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在600nm或更高波长的O.D值。
11. CCK8不能用于细胞染色。
12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
13. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）
14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。
15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。
16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。
17. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片, 450nm滤光片具有最佳灵敏度。
18. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。
19. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、 90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。
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推荐测试剂 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
⑺ 细胞活性检测的方法有多少种
细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、 3H 放射性同位素掺入法、 MTT 法等。其中 MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的 Formazan ，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如 XTT 、 CCK-8 （ WST-8 ）等。
⑻ 求助成骨细胞分化ALP染色活性鉴定问题
目的：通过观察植物雌激素α玉米赤霉醇（α-ZAL）对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的作用，研究植物雌激素α-玉米赤霉醇对大鼠成骨细胞增殖、分化及蛋白表达的影响，探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇在骨代谢中的作用机理，以期为骨质疏松防治药物的研究开阔思路。 方法：1.采用二次酶消化法分离培养新生（24h）SD 乳鼠颅盖骨成骨细胞。2.应用钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红矿化结节染色来鉴定成骨细胞。3.应用噻唑兰(MTT)法测定植物雌激素α-玉米赤霉醇对成骨细胞增殖的影响。4.采用对硝基苯二钠基质动力学法检测了24 h和48h 成骨细胞碱性磷酸酶活性的改变。5.采用免疫组化法观察α玉米赤霉醇对体外培养成骨细胞的Bax、Bcl-2表达的影响。 结果：1.细胞形态学观察：刚接种的原代成骨细胞呈球形，24h内存活细胞已沉降贴壁，培养第2天能够完全展开，呈三角形、梭形，核明显增大；传代培养5天，细胞形态可见多样化，胞浆丰富，向外伸展，伸出多个伪足，与周围细胞的伪足相互连结，细胞半融合；培养一周左右，可见长索形、多角形、条索形，汇合时细胞呈铺路石状，可重叠生长。2.成骨细胞的鉴定：ALP 染色可见90％细胞染色阳性,胞质中出现灰黑色颗粒或块状沉积，矿化结节呈橘红色结节、边界清晰，可证明为成骨细胞。3.对大鼠成骨细胞增殖的影响：大鼠成骨细胞在含有不同浓度（10-5mol/L～10-10mol/L）α玉米赤霉醇以及含有10-10mol/L的雌二醇和无药物的培养基中培养24h后，与E2组比较，α-ZAl10-7mol/L、α-ZAl10-10mol/L 这两种浓度差异无显着性（P＞0.05），说明这两种浓度有促进成骨细胞增殖的作用4.对大鼠成骨细胞外碱性磷酸酶活性的影响：与正常组比较，三组均有显着性差异，与E2组比较，α-ZAl10-7mol/L、α-ZAl10-10mol/L 这两种浓度差异无显着性（P＞0.05），说明这两种浓度均可以促进成骨细胞分泌ALP。在促进成骨细胞分泌ALP的过程中，随着用药天数的增加，ALP 含量也增加。5. Α-ZAL对Bcl-2，Bax蛋白表达分析的影响：α-ZAL（10-7mol/L）组、α-ZAL（10-10mol/L）组抑制成骨细胞凋亡的作用。 结论：1.一定浓度的α-玉米赤霉醇可以促进成骨细胞的增殖分化，说明它们对骨都具有雌激素样活性。2.Bax/Bcl-2 参与成骨细胞的凋亡过程,一定浓度的α-玉米赤霉醇可以通过调节Bax/Bcl-2 起到关键调控作用。
⑼ 细胞活力测定常用的简便方法是
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblue）染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。
⑽ 如何进行兔骨髓间充质细胞ALP活性定量检测
如何进行兔骨髓间充质细胞ALP活性定量检测
髓核细胞与骨髓间充质干细胞共培养，影响髓核细胞的活性，经共培养的髓核细胞增殖速度、蛋白多糖合成量较对照组提高明显，髓核细胞活性上调。 睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞在体外共培养的早期，睾丸支持细胞可以显着促进间充质干细胞的生长，但在后期则反而抑制间充质干细胞的生长。