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流感病毒检测有几种方法

发布时间:2022-12-21 22:55:26

❶ 流感病毒是怎么引起的 流感病毒检测

流感是一种很常见的疾病,甚至很多人都患过流感,但是却很少有人知道引起流感的原因,流感虽然不是什么很严重的疾病,但是不及时治疗越发严重后也有可能会导致死亡,那么流感病毒是怎么引起的?流感病毒检测?
流感病毒是怎么引起的
流感是流行性感冒的简称,是一种由流感病毒引起的急性呼吸道感染。主要的症状有发热、鼻部症状、咳嗽、头痛、全身不适等。在流感大流行期间,老年人、心肺功能不全,或者晚期妊娠的孕妇等高危人群,在患流感后可以导致死亡。甚至一些健康的青年,在流行期间,也可能病情危重而死亡。流感的传染性强,主要通过呼吸道传播。病毒表面有一层包膜,包膜的糖蛋白突起由植物血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)构成。这两种成分是甲型流感病毒分型的主要依据,比如我们经常听到的H5N1和H7N9,就是根据这两种抗原成分来命名的。流感病毒经呼吸道吸入以后,病毒表面的植物血凝素能够识别人体细胞表面的受体并结合,侵入呼吸道的纤毛柱状上皮细胞,在细胞内复制。复制出来的病毒,借助神经氨酸酶的作用,使病毒从细胞内释放。进而再感染其他纤维柱状上皮细胞,引起细胞变性坏死脱落,从而导致上呼吸道局部粘膜的炎症,最终出现全身的毒性症状。

流感病毒检测
流感病毒的检测,包括病毒抗原检测和病毒核酸检测两种方法。病毒抗原检测使用快速抗原检测方法,多数是采用免疫荧光的方法检测呼吸道标本,(包括咽拭子,鼻拭子,鼻咽或管抽取物中的粘膜上皮细胞等)使用单克隆抗体来区分甲、乙型流感,一般可以在数小时内获得结果。其它还有胶体金试验一般能在10到30分钟获得结果。病毒的核酸检测主要是用PCR法来检测呼吸道的标本,包括咽拭子,鼻拭子,鼻咽或气管抽取物,痰中的流感病毒,核酸病毒核酸检测特异性和敏感性最好,且能快速的区分病毒的类型和亚型,一般能在4到6小时内获得结果。

流感病毒有潜伏期吗
流感病毒是有一定潜伏期的,不同的流感病毒潜伏期也不一样。一般情况下潜伏期都在7天之内,禽流感病毒的潜伏期在2-4天左右。在潜伏期之后大部分患者都会出现类似普通感冒的症状,表现为发热,鼻塞流涕,头痛,全身肌肉关节酸痛等症状。随着病毒在体内的蔓延,患者也会在短时间内出现高热抽搐,气促,呼吸困难等症状,需要及时使用抗病毒药物治疗。

流感病毒的特点有哪些
由于流感病毒的活动强度在不同的季节均不等,所以它的流行具有显着的季节性。其原因为不同季节的温度和湿度都不同,这就会导致流感的发生也不同。因此,我们需要在不同的季节采取相对应的防控措施来预防。有研究显示,春夏季节流行性感冒的发生率要显着高于其他的季节,这是因为秋冬季节的气温较低,会降低流感病毒的活力和传播速度。患者年龄越小,其机体内流感病毒的抗体含量就越低,且这个年龄段的机体免疫机制也还尚不完善,因此对流感病毒的抵抗力也就越低。除此以外,在学校这个人口聚集的场所,也是极易发生流行性感冒相互传播的。

❷ 流感病毒的实验室检测方法有哪些

1.外周血检测
白细胞总数一般不高或降低,淋巴细胞增高。重症病例也可以升高。若合并细菌感染,白细胞总数及中性粒细胞上升。
2.血液生化检查
部分病例出现低钾血症,少数病例肌酸激酶、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、肌酐等升高。
3.病原学相关检查
主要包括病毒分离、病毒抗原、核酸和抗体检测。病毒分离为实验室检测的主要方法;病毒的抗原和核酸检测可以用于早期诊断;抗体检测可以用于回顾性调查,但对病例的早期诊断意义不大。
4.影像学检查
部分患者可表现为支气管纹理增多的支气管感染征象,重症患者可出现肺部浸润性病变或胸腔积液,甚至融合成片。

❸ 甲型H1N1流感病毒检测流程

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根据卫生部印发《甲型H1N1流感诊疗方案(2009年试行版第二版)》的通知.
诊断时用病毒核酸检测:以RT-PCR(最好采用real-time RT-PCR)法检测呼吸道标本(咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰)中的甲型H1N1流感病毒核酸,结果呈阳性。就能确诊。
血清甲型H1N1流感病毒核酸检测,结果呈阳性。也能确诊。

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❹ 禽流感病毒和抗体的实验室检测方法分别有哪些各种方法用途分别是什么

病毒检测方法有:
(1)病毒(鸡胚、细胞)分离培养与鉴定,用途为直接分离病毒;
(2)免疫荧光法,用途为检测组织、细胞培养物中病毒抗原;
(3)免疫酶法(包括免疫酶组织化学染色法和免疫过氧化物酶细胞单层试验),用途为检测组织、细胞培养物中病毒抗原;
(4)中和试验,用已知阳性血清检测病毒,金标准方法
(5)血凝/血凝抑制试验,用已知阳性血清检测病毒
(6)乳胶凝集试验,用已知阳性血清检测病毒抗原
(7)胶体金试纸,用已知阳性血清检测病毒抗原
(8)ELISA方法,用已知阳性血清检测病毒抗原
(9)RT-PCR(含荧光RT-PCR),用途为检测病毒核酸
(10)NASBA,用途为检测病毒核酸
(11)核酸探针,用途为检测病毒核酸
(12)基因芯片,检测病毒核酸
(13)核酸序列测定,解析病毒核酸
抗体检测方法
(1)琼脂扩散试验,检测病毒NP和M蛋白抗体
(2)血凝抑制试验,检测病毒HA蛋白抗体,可用于免疫效果评估
(3)神经氨酸酶抑制试验,检测病毒NA蛋白抗体
(4)中和试验,用已知病毒检测血清,金标准方法
(5)ELISA方法,用已知病毒抗原检测特异抗体
(6)胶体金试纸,用已知病毒抗原检测特异抗体
(7)乳胶凝集试验,用已知病毒抗原检测特异抗体

❺ 怎样检测流感病毒

流感病毒的检测有三种方法:第一种方法,也是最快捷的一种方法,称作“流感病毒抗原检测”,方法是由医生或护士采集鼻咽或口咽分泌物,用专门的试剂条检测,半小时内出结果;第二种方法是病毒培养,将鼻咽或口咽分泌物接种到细胞株上,体外培养,通过细胞的形态变化和红细胞凝集试验来判断是否有流感病毒感染;第三种方法是流感病毒核酸检测,通过PCR方法检测流感病毒遗传物质。但是很可惜的是,现在这三种检测方法都不是医院的常规检查项目,也就是说,病人不能像查肝功,血型一样方便的进行流感病毒检测。特别是流感病毒培养和核酸检测两种方法,因为需要特殊的设备和技术条件,在普通医院更难以开展。
参考资料:网络知道日报,《如何分辨是感冒还是流感?》 http://..com/daily/view?id=2002

❻ 流行性感冒病毒的诊断方法

病毒感染还会诱导干扰素的表达和细胞免疫调理,造成一些自身免疫反应,包括高热、头痛、腓肠肌及全身肌肉疼痛等,病毒代谢的毒素样产物以及细胞坏死释放产物也会造成和加剧上述反应。
由于流感病毒感染会降低呼吸道粘膜上皮细胞清除和黏附异物的能力,所以大大降低了人体抵御呼吸道感染的能力,因此流感经常会造成继发性感染,由流感造成的继发性肺炎是流感致死的主要死因之一。
在流行期结合临床症状诊断流感并不困难,但要确诊或流行监测时必须进行实验室检查,主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。
病毒的分离与鉴定
通常采取发病3日内患者的咽洗液或咽拭子,经抗生素处理后接种于9~11日龄鸡胚羊膜腔和尿囊腔中,于33℃~35℃孵育3~4天后,收集羊水和尿囊液进行血凝试验。如血凝试验阳性,再用已知免疫血清进行血凝抑制(hemoagglutination inhibition,HI)试验,鉴定型别。若血凝试验阴性,则用鸡胚再盲目传代3次,仍不能出现血凝则判断病毒分离为阴性。也可用组织培养细胞(如人胚肾或猴肾)分离病毒,判定有无病毒增殖可用红细胞吸附方法或荧光抗体方法。
血清学诊断
采取患者急性期(发病5天内)和恢复期(病程2~4周)双份血清,常用HI试验检测抗体。如果恢复期比急性期血清抗体效价升高4倍以上,即可做出诊断。正常人血清中常含有非特异性抑制物,因此在进行HI试验前可用胰蛋白酶等处理血清,以免影响HI试验结果。HI试验所用的病毒应当是与当前流行密切相关的病毒株,反应结果才能确切。补体结合试验(compliment fixation,CF)只能检测NP、MP的抗体。这些抗体出现早、消失快。因此,CF试验只能作为是否新近感染的指标。
快速诊断
对患者进行快速诊断,主要是采用间接或直接免疫荧光法、ELISA法检测病毒抗原。常取患者鼻甲粘膜印片或呼吸道脱落上皮细胞涂片,用荧光素标记的流感病毒免疫血清进行免疫荧光染色检查抗原,或用ELISA检查患者咽漱液中的抗原。 用单克隆抗体经免疫酶标法仅用24~72小时即可快速检测甲、乙型流感病毒在感染细胞内的病毒颗粒或病毒相关抗原。
PCR、核酸杂交或序列分析等方法也被用于检测流感病毒核酸或进行分型。

❼ 甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案的本方案旨

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案,不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求
1、推荐采集的呼吸道标本种类
疾病发病后应尽快采集如下标本:鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液,并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ (冰箱),并马上送至实验室。(临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。) 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。(附表1)
2、拭子的选择
标本应使用头部为合成纤维的拭子(例如,聚酯纤维),用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液(含有蛋白质稳定剂,阻止细菌和真菌生长的抗生素,缓冲液)
3、临床标本储存要求
保存在4℃(不能超过4天)或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理
标本送至实验室后,立即进行处理,避免反复冻融。将原始标本分为三份,一份用于核酸检测,一份用于病毒分离,一份保存待复核。
5、标本的运输
疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类,用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单(附表2)。
二、核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法,在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒(引物和探针序列为美国CDC设计):
4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针,此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此,用此real-time RT-PCR的方法,建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3(中文翻译版),附件4(英文原版)。
2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒(引物序列为国家流感中心设计):
目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。
三、病毒分离鉴定
可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。
四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全
(一)实验室级别及个人防护
1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作,在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜(BSC)内进行。遵循生物安全三级个人防护。
2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作,应在BSL-3实验室内进行,并遵循生物安全三级个人防护。
(二)健康监测
1、所有人员均应自测发热及其他症状。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适,应立即向上级报告。
3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒,应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。
五、附表和附件
附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单
附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单
附件3: real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)(中文)
附件4: real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)(英文)
附件5: RT-PCR方法检测甲型流感病毒
附件6:甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法
附件7:甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法
附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#
种类 标本量
(g或ml) 采集
日期 备注 ※选项:参照传染病报告卡。
#选项:A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他(如为其他,请在表格中注明)
采集人员: 采集单位(盖章):
附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#
种类 标本量*
(g或ml) 采集
日期 备注 ※选项:参照传染病报告卡
#选项:A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他(如为其他,请在表格中注明)
*标本量:如果同一份标本有多个包装请注明。
填表人员: 送样时间: 单位(盖章):
附件3
real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
中文翻译版(请同时参考英文原版)
请注意:体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。
美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)
本规程所有权归属疾病控制中心,紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
(一)前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
(二)实验原理
实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针,对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计,swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒,swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
(三)使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
(四)生物安全要求
样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
(五)样本要求
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液,气管抽吸物,痰,鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质(如聚脂或涤纶)、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1)未在2-4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2)以上未列的其它不当样本
(六)核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后,再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒,RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司),罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒,在推荐的操作程序下,可提取高纯度的RNA。
(七)免责声明:提到的厂家名仅用作举例,并不表示疾控中心认可。
二、实验材料
(一)试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒;
2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶);
3、正反向引物 (40μM);
4、双重标记探针(10μM);
5、阳性对照。
(二)供给
1、实验室标记笔;
2、微量离心管格栅,96孔0.2ml PCR反应管;
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头;
4、0.2ml PCR 反应管盘;
5、光学反应盖板;
6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管;
7、一次性无粉手套。
(三)仪器设备
1. 微量离心机;
2. 漩涡振荡器;
3. 实时荧光定量PCR检测系统,含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
(一)准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性,应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法:
1)实验准备与核酸提取使用独立区域;
2)实验准备与核酸提取使用专用设备(如移液器,微量离心机)和耗材(如微量离心管,吸头);
3)实验开始后穿清洁工作服,并使用新的一次性无粉手套;
4)不同样本操作之间,以及怀疑可能污染的情况下均更换手套;
5)试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁,用去污剂净化,例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意:在试验过程中,保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1)引物和探针
(1)分装好的冰冻的引物和探针进行融化(已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月,不要对探针反复冻融);
(2)涡旋振荡引物和探针;
(3)瞬时离心引物和探针,之后置于冰架上。
2)Real time RT-PCR的试剂
(1)将Master Mix和酶置于冰架上;
(2)融化2×的Reaction Mix;
(3)颠倒混合2×的Reaction Mix;
(4)瞬时离心2×的Reaction Mix和酶,置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1)每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测:InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的,因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2)对于每一个过程中包括的所有引物和探针,均设立无模板对照(NTC)和阳性模板对照(PTC)。
3)人类样本对照(HSC)提供了次级阴性对照,以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反应
反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中,加入水和提取的核酸或者阳性模板对照(PTC)。
1)为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管;
2)对每一个建立的反应确定反应数(N)。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差,制备过量的反应混合物是必要的。具体如下:
(1)如果包括对照,样品的数量(n)为1到14,那么N=n+1;
(2)如果包括对照,样品的数量(n)大于15,那么N=n+2。
3)Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下:
* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
4)加入水之后,通过上下吹打混匀反应混合物,不要涡旋振荡。
5)离心5s使混合物聚集管底,然后将管子置于冰架上;
6)准备板状的反应管子或者96孔板,置于冰架上;
7)每一个master mix吸取20μl到每一孔中,每排按顺序进行,如下图:
实验建立举例:
实验样本举例:
注意:在任何样本被加入之前,应该首先加入阴性模板对照(NTC)(第1列),用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入(第11列),用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照(PTC)应该在所有样品和阴性模板对照(NTC)之后被加入。
8)在将培养板移到核酸处理区域之前,在试验设定区域,在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。
9)吸取5μl的nuclease free water到NTC孔,将NTC孔盖上。
10)将反应板盖上,移到核酸处理区域。
11)将含有样品的管子涡旋振荡5s,瞬时离心5s;
12)将提取的核酸样本置于冰架上;
13)如上所述,样品应该按列加入,吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中(例如,样本“S1”如上表格所示)。不同样本之间需更换枪头操作。
14)加完样本的孔要盖住,这将会帮助防止样品的交叉污染,并且能够使操作人员记录其加样的具体进程;
15)为了避免交叉污染,必要时更换手套;
16)对剩下的样本,重复步骤13-15;
17)加入5μl的HSC样品加到HSC孔中(第11列)。将HSC孔盖盖。
18)最后,加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中,将PTC孔盖上。
19)如果使用8个管子的条状板子,每一条都要做标签标记,来指明每一个样品的位置(不要在反应管子的顶部标记!)。瞬时离心条状管子10-15s,然后置于冰架上。如果使用培养板,4℃,500g离心30s,置于冰架上。
6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul,反应条件如下:
注:在55度这一步骤中要收集荧光信号(FAM)。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1)探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性,则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的,严格的按照步骤规则重新实验。
2)在37个循环处或者37个循环之前,所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线,这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA,也表明了样本质量合格。然而,可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时,从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本,经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性,则说明:
(1)从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染;
(2)没有足够的人类细胞以备检测;
(3)方法建立和实施不当;
(4)试剂和仪器原因。
3)在40个循环之内,HSC组中InfA,swFluA,swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线,那么有以下解释:
(1)可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。
(2)RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
(3)在40个循环之前,PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效,应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因,订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
(4)当所有对照都满足要求后,如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时,则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性,那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应(swInfA和swH1)的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉,则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性,请联系CDC做进一步指导。
(5)在所有对照都满足要求的前提下,如果在40个循环内,待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1)实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训,熟练掌握后方可进行试验。
2)当样本量不足可能会产生假阴性结果,造成的原因可能是不当的收集,运输或处理。
3)如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制,则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释(例如1:10或1:100)来重复试验。
9、备注
引物和探针参见英文版P7。
附件4
real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程
(英文版)
附件5
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测,筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit (catalog #74104)
2、β-巯基乙醇(SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115)
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit:QIAGEN One step RT-PCR Kit(catalog #210212)
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega catalog #N2111)
6、检测引物
7、Axygen 1.5mL离心管,货号:MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管,货号:PCR-02-C
9、Axygen 10μL,100μL,200μL,1000μL带滤芯枪头
10、10μL,100μL,200μL,1000μL加样器
11、可调转速14K离心机:
12、旋涡混合器:
13、生物安全柜:二级生物安全柜
14、PCR仪:
15、琼脂糖:Biowest Agarose Distributed by Gene Tech(Shanghai)Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料:
17、电泳液:5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718.电泳槽、电泳仪
四、实验步骤
(一)RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液:从Kit中取出RLT液,用1.5mL离心管分装,每管500μL(在体系配制区操作)。
2、在生物安全柜内将采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)取100μL加入RLT液管中,充分混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇,混匀后依次加入600μL 70%的乙醇,充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管,打开包装将其做好标记。取步骤(3)中的混合液600μL加入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上,将步骤(3)剩余的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液,12000rpm,离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管,将离心后的滤柱移到新的收集管上,于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液,12000rpm,离心15s。
8、弃收集管中的离心液,再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液,13000~14000rpm,离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上,向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water,室温静置1~3min。
10、12000rpm,离心1min,收集离心液即为提取的病毒RNA,立即做实验或-20℃以下保存。
注意:Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
(二)反应体系配制
1、实验设计:
检测标本RNA
质控参数:
阴性对照:无菌水(标本RNA提取时,跟标本同时提取无菌水。)
阳性对照:已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制(在体系配制区配反应液)
1)按下表加入试剂:
PCR反应体系 组 分 体 积(μL) RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer 11.9×n
5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n Total 20×n 对每一个建立的反应确定反应数(n=拟进行的PCR管数,包括阴性,阳性对)。考虑到阴性无模板对照,阳性对照,误差,制备过量的反应混合物是必要的。具体如下:
(1)如果包括对照,样品的数量(n)为1到14,那么N=n+1;
(2)如果包括对照,样品的数量(n)大于15,那么N=n+2。
2)将上述反应液混匀,分装到0.2mL PCR小管中,每管20μL,分别做好标记。
3)加RNA模板(在核酸提取区)
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管(5μL无菌水),然后分别加标本RNA(每管5μL),最后加入阳性对照RNA(每管5μL)。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀,短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增,反应程序如下: 温度 (C) 时间 循环数 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR产物检测
1)2.0%琼脂糖凝胶制备:称取2.0g Agarose,倒入耐热玻璃瓶内,再加入电泳液(1×TBE)100mL,轻轻混匀后加热,使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50~60℃左右,加入核酸染料,轻轻混匀(不要产生气泡)。待胶温度降至50℃左右时,将其倒入制胶板,插好电泳梳子。待胶完全凝固(约30~60min)之后,将梳子拔出。
2)将制备好的电泳胶放入电泳槽(带梳子孔的一端在阴极),倒入电泳液(1×TBE)浸过胶面即可。
3)PCR产物各取10μL,加入2μL上样缓冲液(6×Loading Buffer),混匀后加入电泳胶孔内(先加Marker(DL-2000)5μL,然后依次加标本PCR产物,再加阴性对照,最后加阳性对照产物)。
4)电泳电压100V,约30~40min后看结果。
5)将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断
在系统成立,即阴阳性参考均正常的条件下,各引物所代表意义如下: PCR引物 待检样品1 待检样品2 待检样品3 待检样品4 待检样品5 待检样品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 结果判断 非甲型流感病毒 甲型流感病毒
非H1N1亚型 人季节性H1N1亚型流感病毒 猪H1N1亚型流感病毒
送国家流感中心复核 送国家流感中心检测 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

❽ 高致病性禽流感诊断方法和程序是什么

(1)流行病学

禽流感病毒的宿主广泛,鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。其中以鸡和火鸡感染禽流感病毒后的危害最为严重,而在鸭中分离到的病毒比其他禽类多。各种日龄的禽均可感染。

禽流感病毒主要通过与患禽(包括与患禽接触的器具)的直接接触和间接接触传染。此外,带毒的飞鸟或水禽常常成为传染源,引起家禽大批发病和死亡。

(2)临床症状

禽流感的潜伏期从几小时到3天不等,潜伏期的长短依赖于感染病毒的毒力和剂量、感染途径、被感染禽的种别和禽体的状态。急性感染的禽流感无特定临床症状,在短时间内可见食欲废绝,体温骤升,呼吸道症状,下痢,后期出现神经症状。伴随大量死亡。

(3)病理变化

禽流感的病理变化因感染毒株毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而变化不一。主要表现为头肿,肉髯、冠出血,小腿和趾部皮下出血,腺胃乳头出血及输卵管炎等。

(4)病原学诊断

病毒分离需由国家规定的实验室完成。

(5)血清学诊断

目前用于禽流感检测的方法有禽流感病毒分离技术、琼脂扩散(AGP)试验、血凝试验、血凝抑制(HI)试验、神经氨酸酶抑制(NI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(SN)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫荧光技术(IF)及核酸探针技术。其中血凝试验、血凝抑制试验和琼脂扩散试验是OIE推荐使用的方法。

禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供,按说明书操作。

❾ 流行性感冒要点

  最近流感爆发,疾控又开始紧张,开始各种培训,提高大家意识,也算是记录培训笔记了。

流行性感冒

      (以下简称流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,在世界范围内引起暴发和流行。流感起病急,虽然大多为自限性,但部分因出现肺炎等并发症可发展至重症流感,少数重症病例病情进展快,可因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和/或多脏器衰竭而死亡。重症流感主要发生在老年人、年幼儿童、孕产妇或有慢性基础疾病者等高危人群,亦可发生在一般人群。

      2017年入冬以来,我国南北方省份流感活动水平上升较快,当前处于冬季流感流行高峰水平。全国流感监测结果显示,流感样病例就诊百分比和流感病毒检测阳性率均显着高于过去三年同期水平,流感活动水平仍呈现上升态势,本次冬季流感活动强度要强于往年。

      为进一步规范和加强流感的临床管理,减少重症流感发生、降低病死率,在《甲型H1N1流感诊疗方案(2009年第三版)》和《流行性感冒诊断与治疗指南(2011年版)》的基础上,结合近期国内外研究成果及我国既往流感诊疗经验,制定本诊疗方案。

1、病原学

    流感病毒属于正粘病毒科,为RNA病毒。根据核蛋白和基质蛋白分为甲、乙、丙、丁四型。

    目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。

    流感病毒对乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒剂敏感;对紫外线和热敏感,56℃条件下30分钟可灭活。

2、流行病学

(一)传染源

    流感患者和隐性感染者是流感的主要传染源。从潜伏期末到急性期都有传染性。受感染动物也可成为传染源,人感染来源动物的流感病例在近距离密切接触可发生有限传播。

    病毒在人呼吸道分泌物中一般持续排毒3-6天,婴幼儿、免疫功能受损患者排毒时间可超过1周,人感染H5N1/H7N9病例排毒可达1~ 3周。

(二)传播途径

    流感主要通过打喷嚏和咳嗽等飞沫传播,也可经口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或间接接触传播。接触被病毒污染的物品也可引起感染。人感染禽流感主要是通过直接接触受感染的动物或受污染的环境而获得。

(三)易感人群

    人群普遍易感。接种流感疫苗可有效预防相应亚型的流感病毒感染。

(四)重症病例的高危人群

    下列人群感染流感病毒,较易发展为重症病例,应给予高度重视,尽早(发病48小时内)给予抗病毒药物治疗,进行流感病毒核酸检测及其他必要检查。

1.年龄<5岁的儿童(年龄<2岁更易发生严重并发症);

2.年龄≥65岁的老年人;

3.伴有以下疾病或状况者:慢性呼吸系统疾病、心血管系统疾病(高血压除外)、肾病、肝病、血液系统疾病、神经系统及神经肌肉疾病、代谢及内分泌系统疾病、免疫功能抑制(包括应用免疫抑制剂或HIV感染等致免疫功能低下);

4.肥胖者[体重指数(body mass index,BMI)大于30,BMI=体重(kg)/身高 (m) 2];

5.妊娠期妇女。

3、发病机制及病理

(一)发病机制

    甲、乙型流感病毒通过HA结合呼吸道上皮细胞含有唾液酸受体的细胞表面启动感染。流感病毒通过细胞内吞作用进入细胞,病毒基因组在细胞核内进行转录和复制。复制出大量新的子代病毒颗粒。流感病毒感染人体后,可以诱发细胞因子风暴,导致全身炎症反应,出现ARDS、休克及多脏器功能衰竭。

(二)病理改变

    病理变化主要表现为呼吸道纤毛上皮细胞呈簇状脱落、上皮细胞化生、固有层粘膜细胞充血、水肿伴单核细胞浸润等病理变化。重症肺炎可发生弥漫性肺泡损害。合并脑病时出现脑组织弥漫性充血、水肿、坏死。合并心脏损害时出现心肌细胞肿胀、间质出血,淋巴细胞浸润、坏死等炎症反应。

4、临床表现和实验室检查

  潜伏期一般为1-7天,多为2-4天。

(一)临床表现

    主要表现为发热、头痛、肌痛和全身不适起病,体温可达39-40℃,可有畏寒、寒战,多伴全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等全身症状,常有咽喉痛、干咳,可有鼻塞、流涕、胸骨后不适等。颜面潮红,眼结膜充血。部分以呕吐、腹痛、腹泻为特点,常见于感染乙型流感的儿童。

    无并发症者病程呈自限性,多于发病3-4天后体温逐渐消退,全身症状好转,但咳嗽、体力恢复常需1-2周。

(二)并发症

    肺炎是流感最常见的并发症,其他并发症有神经系统损伤、心脏损害、肌炎、横纹肌溶解综合征和脓毒性休克等。

(三)实验室检查

1.外周血常规:白细胞总数一般不高或降低,重症病例淋巴细胞计数明显降低。

2.血生化:部分病例出现低钾血症,少数病例肌酸激酶、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、肌酐等升高。

3.病原学相关检查:

(1)病毒核酸检测:以RT-PCR(最好采用real-time RT-PCR)法检测呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸。病毒核酸检测的特异性和敏感性最好,且能区分病毒类型和亚型。(2)病毒抗原检测(快速诊断试剂检测):快速抗原检测方法可采用胶体金和免疫荧光法。由于快速抗原检测的敏感性低于核酸检测,因此对快速抗原检测结果的解释应结合患者流行病史和临床症状综 合考虑。

(3)血清学检测:检测流感病毒特异性IgM和IgG抗体水平。动态检测的IgG抗体水平恢复期比急性期有4倍或以上升高有回顾性诊断意义。

(4)病毒分离培养:从呼吸道标本中分离出流感病毒。在流感流行季节,流感样病例快速抗原诊断和免疫荧光法检测阴性的患者建议也作病毒分离。

(四)影像学表现并发肺炎者影像学检查可见肺内斑片状、磨玻璃影、多叶段渗出性病灶;进展迅速者,可发展为双肺弥漫的渗出性病变或实变,个别病例可见胸腔积液。

儿童病例肺内片状影出现较早,多发及散在分布多见,易出现过度充气,影像学表现变化快,病情进展时病灶扩大融合,可出现气胸、纵隔气肿等征象。

5、诊断

诊断主要结合流行病学史、临床表现和病原学检查。

(一)临床诊断病例

出现上述流感临床表现,有流行病学证据或流感快速抗原检测阳性,且排除其他引起流感样症状的疾病。

(二)确定诊断病例

有上述流感临床表现,具有以下一种或以上病原学检测结果阳性:

1.流感病毒核酸检测阳性(可采用real-time RT-PCR和RT-PCR 方法)。

2.流感病毒分离培养阳性。

3.急性期和恢复期双份血清的流感病毒特异性IgG抗体水平呈4倍或4倍以上升高。

6、重症与危重病例

(一)出现以下情况之一者为重症病例

1.持续高热>3天,伴有剧烈咳嗽,咳脓痰、血痰,或胸痛;

2.呼吸频率快,呼吸困难,口唇紫绀;3.神志改变:反应迟钝、嗜睡、躁动、惊厥等;

4.严重呕吐、腹泻,出现脱水表现;

5.合并肺炎;

6.原有基础疾病明显加重。

(二)出现以下情况之一者为危重病例

1.呼吸衰竭;

2.急性坏死性脑病;

3.脓毒性休克;

4.多脏器功能不全;

5.出现其他需进行监护治疗的严重临床情况。

7、鉴别诊断

(一)普通感冒

流感的全身症状比普通感冒重;追踪流行病学史有助于鉴别;普 通感冒的流感病原学检测阴性,或可找到相应的感染病原证据。

(二)其他类型上呼吸道感染

包括急性咽炎、扁桃体炎、鼻炎和鼻窦炎。感染与症状主要限于相应部位。局部分泌物流感病原学检查阴性。

(三)其他下呼吸道感染

流感有咳嗽症状或合并气管-支气管炎时需与急性气管-支气管炎相鉴别;合并肺炎时需要与其他肺炎,包括细菌性肺炎、衣原体肺炎、支原体肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、肺结核等相鉴别。根据临床特征可作出初步判断,病原学检查可资确诊。

8、治疗

(一)基本原则

1.对临床诊断病例和确诊病例应尽早隔离治疗。

2.住院治疗标准(满足下列标准1条或1条以上):

(1)妊娠中晚期妇女。

(2)基础疾病明显加重,如:慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、慢性心功能不全、慢性肾功能不全、肝硬化等。

(3)符合重症或危重流感诊断标准。

(4)伴有器官功能障碍。

3.非住院患者居家隔离,保持房间通风。充分休息,多饮水,饮食应当易于消化和富有营养。密切观察病情变化,尤其是儿童和老年患者。

4.流感病毒感染高危人群容易引发重症流感,尽早抗病毒治疗可 减轻流感症状,缩短流感病程,降低重症流感的病死率。

5.避免盲目或不恰当使用抗菌药物。仅在流感继发细菌性肺炎、中耳炎和鼻窦炎等时才有使用抗生素的指征。

6.儿童忌用阿司匹林或含阿司匹林药物以及其他水杨酸制剂。

(二)对症治疗

高热者可进行物理降温,或应用解热药物。咳嗽咳痰严重者给予止咳祛痰药物。根据缺氧程度可采用鼻导管、开放面罩及储氧面罩进行氧疗。

(三)抗病毒治疗

抗流感病毒治疗时机

发病48h内进行抗病毒治疗可减少流感并发症、降低住院患者的病死率、缩短住院时间,发病时间超过48h的重症患者依然能从抗病毒治疗中获益。

重症流感高危人群及重症患者,应尽早(发病48h内)给予抗流感病毒治疗,不必等待病毒检测结果;如果发病时间超过48h,症状无改善或呈恶化倾向时也应进行抗流感病毒治疗。无重症流感高危因素的患者,发病时间不足48h,为缩短病程、减少并发症也可以抗病毒治疗。

2.抗流感病毒药物

神经氨酸酶抑制剂(NAI)对甲型、乙型流感均有效。

(1)奥司他韦:成人剂量每次75mg,每日2次,疗程5天,重症病例剂量可加倍,疗程可延长。肾功能不全者要根据肾功能调整剂 量。1岁及以上年龄的儿童应根据体重给药:体重不足15Kg者,予30mg每日2次;体重15~23Kg者,予45mg每日2次;体重23~40Kg 者,予60mg每日2次;体重大于40Kg者,予75mg每日2次。对于吞咽胶囊有困难的儿童,可选用奥司他韦颗粒剂。对用药过程中无效或病情加重的患者,要注意是否出现耐药。

(2)扎那米韦:适用于于成人及7岁以上青少年,用法:每日2次,间隔12小时;每次10mg(分两次吸入)。但吸入剂不建议用于重症或有并发症的患者。

(3)帕拉米韦:成人用量为300~600mg,小于30d新生儿6mg/kg, 31-90d婴儿8mg/kg,91d-17岁儿童10mg/kg,静脉滴注,每日1次, 1~5天,重症病例疗程可适当延长。目前临床应用数据有限,应严密观察不良反应。

离子通道M2阻滞剂金刚烷胺和金刚乙胺仅对甲型流感病毒有效,但目前监测资料显示甲型流感病毒对其耐药,不建议使用。

(四)重症病例的治疗

治疗原则:积极治疗原发病,防治并发症,并进行有效的器官功能支持。

1.如出现低氧血症或呼吸衰竭,应及时给予相应的治疗措施,包括氧疗或机械通气等。

2.合并休克时给予相应抗休克治疗。

3.出现其他脏器功能损害时,给予相应支持治疗。

4.出现继发感染时,给予相应抗感染治疗。

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