生物多样性检测的设备和方法

1. 如何用环境DNA来有效和准确地测量生物多样性

2018年7月29日报道，近日，《通讯-生物学》发表的一项研究Acidity promotes degradation of multi-species environmental DNA in lotic mesocosms描述了环境DNA （eDNA） 在自然环境里的持久性和影响其持久性的因素。

班戈大学的Simon Creer及同事使用了四个高地流水的、有酸碱梯度的围隔生态系统，来测量各种环境DNA在不同的时间和空间里的降解程度。他们发现，eDNA的持久性只有2天， 而且酸性环境会加速它的降解。

综上所述，他们的实验结果为研究影响流水里的环境DNA到因素提供了一个预计的时空框架， 为有效和准确地用eDNA 来实时测量生物多样性做出了贡献。

2. 废水中微生物多样性的检测有几种方法

solemon23(站内联系TA)有没有水处理的高手，只想得到水中微生物多样性程度，比如某水体中微生物多样性达到中度多样性。 现在分子生物学手段比较盛行，PCR，克隆，DGGE等。凡龙(站内联系TA)没有简单方法，只有专业方法，PCR喽bill2064(站内联系TA)可以尝试biolog 但它只针对好氧微生物echo1234(站内联系TA)PCR-DGGE吧 大概可以看出多样性程度 成本相对不高cz200717(站内联系TA)一般的生态分析方法的话，DGGE和RFLP应该都可以。稍微先进点的话就做一下RT-PCR……

3. 微生物检测实验室装备有哪些

微生物实验室主要负责各种微生物项目的检测，主要检测项目有菌落总数、菌落类型、致病球菌等等。微生物实验室根据不同的分级，有着不同的安全要求和使用要求，因此微生物实验室不同于一般的实验室（净化）工程的建设理念。

微生物检测实验室的建设基础要求是墙壁表面必须光滑防水耐腐蚀，地面无渗漏，光洁但不滑，仪器和设备的陈设简洁，方便打扫、便于消毒清洁，让实验环境尽量保持(洁净)无菌状态。微生物检测实验室的基本家具包括：实验台、超净工作台、生物安全柜等。
为了方便打扫和清洁，建议选择隔离式中央实验台，具备功能区干湿隔离模块，可以防潮抗腐，干湿区域分离，实验更安全。较好的隔离式中央实验台还应配备全工位水电气供给功能，灵活配合实验需求；为了方便存取试剂，还可以充分利用空间设计立体试剂存储空间。

另外，为给微生物检测实验提供更好的实验环境，且要保证实验结果的准确性，实验室对环境的洁净要求极高，为了保证实验环境的无菌和安全，必须要选择不锈钢材质的超净工作台和生物安全柜。

4. 生物实验室必备设备有哪些

1、样品保存:
冰箱/超低温冰箱(荷兰SKADI)
液氮罐(英国STATEBOURNE CRYOGENICS)

2、样品前处理:
移液器(gilson,ependof,biocos)
天平(梅特勒，赛多利斯)
均质/搅拌系列(IKA,KINEMATICA,LABSCAN)
离心机(sigma,日立，ebendof,hettich,beckman)
冻干机(荷兰SKADI)
高压灭菌器(MMM,SANYO,STURDY)
电泳仪(bio-rad,epondorf)

3、培养过程
培养箱系列(美国SI)
生物安全柜/超净工作台(telstar,baker,thermo)
发酵罐(infors，labconco)
摇床(IKA,INFORS,LAB-LINE)
水浴(LABSCAN,JULABO)
转瓶机(WHEATON,IBS)
PCR(thermo，epondorf,ABI,BIO-RAD,MJ)
酶标仪(Awareness，epondorf,ABI)

4、观察分析
显微镜(Hund,olympus，leica，nikon)
菌落计数仪(INTERSCIENCE)
流式细胞仪(bd,日立)
DNA测序仪(ABI)
高效色谱系列(agilent,whatman,abi,dionex,mathon)

5、其它
洗瓶机(labconco，miele)
超纯水系列(MILLIPORE,ELGA,PALL)
超声波清洗(英国Prima)

微生物实验室主要用于无菌环境下微生物提纯、分离、增殖及鉴定等工作，对无菌环境的要求很高。那么微生物实验室中需要用到哪些仪器设备呢？

一、无菌室

无菌室是实验室的核心部分，主要为样品提供保护，保证实验结果的准确和人员的安全。

二、超净工作台

微生物的培养都是在特定培养基中进行无菌培养，那么无菌培养必然需要超净工作台提供一个无菌的工作环境。超净工作台的主要用途是微生物的接种及处理时的无菌操作。

六、微波炉/电炉

其主要作用是用于溶液的快速加热，微生物固体培养基的加热溶化等。

七、摇床

摇床又称摇瓶机，它是培养好气性微生物的小型试验设备或作为种子扩大培养之用。

八、冰箱

冰箱是实验室中保存试剂和样品必不可少的仪器。微生物学实验中用到的试剂有些要求是4度保存，有些要求是负20度保存，实验人员一定要看清试剂的保存条件，放置在恰当的温度下保存。

九、显微镜

微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察清楚它们的个体形态和细胞结构。因此，在微生物学的各项研究中，显微镜就成为不可缺少的工具。

十、生物安全柜

微生物实验中所涉及到的部分试剂和样品微生物有些是有毒的，对于操作人员来说伤害比较大。为了防止有害德悬浮微粒、气溶胶的扩散，可以利用生物安全柜对操作人员、样品及样品间交叉感染和环境提供安全的保护作用。

微生物实验室用到的仪器设备都有哪些

A2生物安全柜

十一、菌落计数器

菌落计数仪可帮助操作者计数菌落数量。通过放大，拍照，计数等方式来准确的获取菌落的数量。有些高性能的菌落计数器还可直接连接电脑来完成自动计数的操作，方便快捷的计数。

十二、分光光度计

分光光度计在微生物试验中用于测定微生物悬液的浓度，可以正确选取合适的培养时间。

十三、离心机

离心机是用于收集微生物菌体以及其他沉淀物。有冷冻离心机和常温离心机之分。

十四、液氮罐

液氮罐里装有液氮，可用于微生物实验室中各菌种的长期保存。

5. 生物多样性监测方法有哪些

检测遗传多样性的方法随生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善。 从形态学水平、细胞学（染色体）水平、生理生化水平、逐渐发展到分子水平。然而不管研究是在什么层次上进行，其宗旨都在于揭示遗传物质的变异。

6. 细菌16S微生物多样性研究实验方法及关键点

1. 样品元基因组提取

1.1 样品元基因组抽提核心思想：

尽可能多的获得样本中各种微生物的基因组DNA。

1.2 样本元基因组提取的重要性：

最大程度获得样本中各种微生物的基因组DNA，为后续样本的分析和比较提供完整的微生物种类及丰度信息。否则，分析环节“形同虚设”，永远分析不出真实结果。

1.3 对样品的一些思考：

a）样本收集的难易程度；

b）样本的珍贵程度；

c）怎样用尽可能少的单个样本使用量来帮助客户完成研究目的；

d）怎样在实验开始前就确保客户结果的准确性；

e）复杂环境中的样本基因组如何能够更全面的获取。

1.4 元基因组提取的主要原理（核心步骤）：

①通过高温化学裂解法和物理击打法充分裂解细胞； 

②离心法除去杂质、抑制物等；去除破碎细胞中的蛋白质；

③纯化DNA； 

④消化RNA。

1.5 元基因组提取的主要流程：

1）样品准备：

样本-80℃保存；

避免样本出现反复冻融，影响样本中微生物组成，样本均在冰盒或干冰上完成拿取和转移。

2）化学裂解+物理击打

I.化学裂解：

作用：采用化学方式破坏细胞膜和细胞核膜充分释放细胞内容物。

II.物理击打：

作用：针对细胞膜难以裂解或裂解不充分的微生物，采用玻璃珠碰撞产生剪切力进行物理干预破坏；

材料：玻璃珠。

3）酚类及生物碱干扰物的去除

PVPP：

作用：

a）去除酚类和生物碱； 

b）可参与配制适合的缓冲溶液反复浸提体系中的DNA，同时吸附杂质。

4）蛋白质、杂质、抑制剂干扰物的去除

HTR等试剂

纯化DNA；

Rnase A 消化RNA；

获得DNA溶液；

2. PCR文库扩增

2.1 高保真pfu酶的使用：

作用：

①降低扩增环节碱基错配率； 

②校正作用； 

③保真性大于Taq酶； 

④产生平末端。

2.2 最低循环数的控制：

a）循环数对PCR扩增的影响：

    1）降低扩增环节碱基错配率；

    2）校正作用；

    3）保真性大于Taq酶；

    4）产生平末端。

b）解决方法：

    1）根据样本来源及类型，利用预实验对扩增反应条件进行摸索，用最低的循环数获得满足后续实验浓度要求的扩增产物。

    2）因样本间存在质量差异等情况，应保持每个样本扩增的循环数统一。

c）扩增DNA模板浓度的均一性

    根据样本类型和来源，将扩增时样本DNA浓度调整至一致，以免由于样本DNA浓度差异造成扩增后产生偏差，增加样本间的可比性。

d）建库扩增循环数

    1）采用扩增形式进行接头添加；

    2）利用最低循环数确保完成建库。

3.实验过程质控

3.1 阴、阳性对照设置

1）元基因组提取环节：

①设置阳性对照，监控提取效果； 

②设置阴性对照，监控提取流程。

2）PCR环节：

①设置阳性对照，监控扩增效果； 

②设置阴性对照，监控PCR操作流程； 

③扩增抽提环节阴性对照，监控抽提是否有污染； 

④扩增抽提环节阳性对照，验证抽提效果。

4.数据分析优先级的确定

4.1 下机数据分析优先级：

1）分析阳性对照：观察实验、测序环节是否有问题；

2）比较分析不同测序run之间的阳性对照，排除测序批次间的差异性。

3）按照要求分析该批次中的样本。

7. 微生物检测手段及注意事项

1. 微生物计量法

1.1 体积测量法

又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液(如10 mL)放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间(如5 min)和转速(如5000 rpm)，离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

1.2称 干重法

可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

1.3 比浊法

微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600 nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.coli的生长及诱导时间。

1.4 菌丝长度测量法

对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。

2. 微生物计数法

2.1 血球计数板法

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1 mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2 染色计数法

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

2.3 比例计数法

将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4 液体稀释法

对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5 mL试样，接种1 mL到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN(Most Probable Number)得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5 平板菌落计数法

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9 cm的平板上出现50~500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的'细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

2.6 试剂纸

在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7 膜过滤法

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

3. 间接测定法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。

3.1 测定含氮量

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

3.2 测定含碳量

将少量(干重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加热30分钟后冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

3.3还原糖测定法

还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。

3.4 氨基氮的测定

离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02 mol/L的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02 mol/L的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。

3.5 其他生理物质的测定

P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸，产气，产CO2(用标记葡萄糖做基质)，耗氧，黏度，产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。

4. 商业化快速微生物检测法

微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：

4.1 试剂盒，培养基等手段

抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如：抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。

4.2 借助新型先进仪器

BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(Impedance Technology)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是Optical Density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是：505 nm测菌丝菌体、560 nm测酵母、600 nm测细菌。用测OD方法画微生物生长曲线时，同一株菌的起始培养浓度可以准备多管(根据检测点的需要，如需检测10个点，就准备10管)，然后每个点取一管出来测OD值就行了。

一般测菌体密度的OD的波长范围是580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌用600 nm，已经属于可见光区(200 nm～400 nm为紫外光区，400 nm～800 nm为可见光区)。空白如用水做，需要离心洗涤菌体;空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤，但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在这个区内的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀释后再测，因为OD太大，分光光度计的灵敏度就会显着降低。

一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。

另，用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600 nm

这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600 nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌，其实在400多纳米处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰。

8. 生物群落多样性的测度方法有哪些

群落的物种数目，即物种丰富度，是最古老、同时也是最基本的一个多样性概念，从对它的估计中可以得到关于物种灭绝速率方面的信息，这对生物多样性保护是非常重要的。已经提出了很多方法来估计九落中的物种数目，这些方法可以分为两大类，即基于理论抽样的方法和基于数据分析的方法。前者包括经典估计方法和贝叶斯估计方法；后者包括对正态分布的积分方法、再抽样方法和种－面积曲线的外推方法。

9. 生物监测的生物监测手段

主要有：①利用指示生物来监测，如根据颤蚓、蛭等大型底栖无脊椎动物和摇蚊幼虫，以及某些浮游生物在水体中的出现和消失、数量的多少等来监测水体的污染状况。利用污水生物系统监测水体污染也是一种常用的手段。②利用水生生物群落结构的变化来监测。水质状况发生变化，水生生物群落结构也会发生相应的改变。在有机物污染严重、溶解氧很低的水体中，水生生物群落的优势种只能由抗低溶解氧的种类组成；未受污染的水体，水生生物群落的优势种则必然是一些清水种类。在利用指示生物和群落结构监测水体污染时，还引用了生物指数和生物种的多样性指数等数学手段，简化监测的方法。③水污染的生物测试，即利用水生生物受到污染物的毒害所产生的生理机能的变化，测试水质污染的状况。这种方法可以测定水体的单因素污染，对测定复合污染也能收到良好的效果。测试方法分为静水式生物测试和流水式生物测试。
对土壤污染进行生物监测也是一种可行的途径，但国内外做的工作还不多。环境系统十分复杂，生物监测只有与物理、化学监测结合起来，才能取得更好的效果。

10. 自然保护区生物多样性保护监测措施

人类与自然界所有的生物都息息相关、处于同一个生态系统，保护生物多样性，应科学、系统地建立生物多样性监测体系，为物种生存、繁衍提供良好的环境氛围；
生物多样性保护技术包括野生动物监测管理、野生植物监测管理、古树名木监测管理以及动物救助管理四个方面。
物联英卡的野生动物监测管理技术是充分利用高空视频、高清视频、无人机视频和红外相机进行连续观测，采用AI识别方法对保护区内的野生动物多样性种群数量、属科目多样性、新发现物种、新分布栖息地等进行监测、识别、分类和数据汇总，为野生动保护成效评价提供数据支撑。
野生植物的监测保护通过实时连续观测物候图像和气候环境大数据，建立珍稀植物生长和生境数据库，对生长状态、生存环境、变化趋势等进行有效分析评估，为科学保护野生植物和人工培养提供数据支撑。
古树名木监测管理是对古树名木进行实时连续有效观测，包括安防监测、倒伏监测、物候监测，建立专项数据库，结合气候监测数据和土壤等环境监测数据，对生长状态、变化趋势等进行有效分析评估，加强古树名木有效保护力度。
动物救助管理是对救助过程、动物状态进行信息化记录管理，并提出合理化建议，便于自然保护区开展动物救援工作。
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