1. . 细胞周期有哪几个检测点及其作用特点
1. 前期 染色体短而粗，两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极，核仁逐渐消失
2.
中期 核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。 3．后期 染色单体分为两组，细胞波拉长
4．末期 染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁
2. 细胞周期如何检测
碘化丙啶（propidium iodide, PI）检测凋亡细胞
早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
主要操作步骤如下：①组织块用0.25%胰酶消化30min~1h。②200~400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。③75％乙醇（-20℃预冷）固定细胞1h。④加入PI（终浓度50g／mL）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50g／mL）1mL染色30min~1h。⑤流式细胞仪检测细胞周期和凋亡
细胞凋亡情况观察及凋亡率检测
培养48h后细胞分为两部分，一部分行碘化丙啶( pI )染色，倒置相差显微镜下观察细胞核形态变化。另一部分以胰酶消化后收集， 以1800r／min离心5min，弃培养基，用4℃预冷的PBS洗细胞2次，离心去PBS，加入 4℃预冷的70％的乙醇 4℃固定1h，离心弃去固定液， 用 4℃预冷PBS 3ml 洗细胞2次，加人1ml PI，4℃避光30mi n 。采用流式细胞仪检测凋亡率。
http://www.biomart.cn/article/9/42/47/162/7437.htm 流式检测细胞周期
要点： 最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！
1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；
2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；
3、 细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以 减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）；
4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！ 5、一般选择4℃固定过夜；
6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；
7、 关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道，响应的 求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主 要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。 8、检测时细胞要达到1～2×106个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始条件相同，又可搜 集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪 的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！
3. 细胞周期数据分析求助
细胞周期至少有两种做法，最常见的如下图分析：
这个是BrdU和7-AAD方法检测细胞周期。红色的gate就是G1期，绿色的就是S期，橙色的就是G2/M期。BrdU, PI, 或者EdU方法和这个一样分析
如果单用PI等DNA染料染色，需要专业软件来分析计算了。
比如这个图，是DNA染料单染，其中粉色部分是G1期，黄色部分是S期，绿色部分是G2/M期。中间的分布一般是通过FlowJo这样的软件计算自动生成的。
4. 流式检测细胞周期都有哪些染色方法
从分类上来说，一般有两类：第一类是只染DNA。这类方法比较简单，用酒精固定细胞后，直接加含有RNA酶的荧光染料，比如PI等，然后就可以直接上机。
第二类另外加了一个步骤，在细胞培养液中加入核苷酸的模拟物，比如BrdU或者EdU。细胞新合成的DNA上就会有这些物质。在不同时间点收集细胞，用DNA染料染DNA的同时，还以用抗体或者化学发光法染核苷酸模拟物也发荧光。这个方法的有点就是不仅可以像第一类方法一样，看到处于细胞周期各个期的百分率，另外还可以看到有多少DNA是新合成的。是一个动态的过程。
5. 细胞周期检测方法即PI法的操作步骤
1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析： 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
6. 求细胞周期检测方法：PI法操作步骤
1、
0.25%胰酶（无EDTA）消化，将细胞消化成单个。（必须消化成单个）。
2、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次（加3ml，吹悬，离心，弃上清算洗一次）。
3、加入3ml预冷（-20度）70%乙醇到细胞沉淀中，于4度固定过夜（或者，如果实验周期长可以-20℃长期固定）。
4、离心收集细胞，以3mL的PBS洗细胞两次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL
RNase
A，
0.2%
Triton
X-100，
4℃避光孵育30分钟。
5、送实验室，上机
7. 细胞周期长短到底是怎么测定的
A 不同时候，很多环境因素不一样。比如清晨和正午的温度不同，酶活性不同，细胞周期相应的也不同。
B 上面的例子说了，温度会影响。
C 解离的材料是离体的，当然就不影响细胞周期。解离时间过短，细胞分开不够，重叠在一起，不好观察，误差很大；解离时间过长，细胞破裂，误差也很大。
D 器材不会影响细胞周期。 举个例子：PH测定时，紫色石蕊试液的用量会不会影响结果？当然不会（正常用量范围哈）
综上，选C
你的悬赏金太少了，你看我打好多字呦！要不是我晓得答案，我还真没动力回答你。
8. 细胞周期测定
儿童白血病细胞DNA含量及细胞周期的临床分析
刘爱国 胡 群 陶红芳 张柳清 胡 迎
华中科技大学附属同济医院儿科(湖北 武汉) 430030
中国图书分类号 R725·2 文献标识码 B 文章编号 1001-4411 (2008) 07-0980-03
【摘 要】 目的:探讨小儿急性白血病(AL)患者骨髓细胞周期分布与分型和治疗的关系。方法:应
定96例小儿AL骨髓单个核细胞DNA含量和细胞周期。结果:不同类型的AL异倍体发生率不同,急性淋巴
异倍体率55·7% (44/79),明显高于急性非淋巴细胞白血病(ANLL)的29·41% (5/17), T-ALL异倍体
高于B-ALL (41·67% ),统计学差异均有显着意义。AL初诊病例和复发病例的G0/G1期细胞比例高于完全
G2M+S期比例低于完全缓解组和对照组(P<0·05),完全缓解组和对照组无显着差异。结论:图像分析系统
异倍体的分析,有利于判断高危ALL,对细胞周期的测定给化疗个体化提供了具体的参考指标。
【关键词】 儿童白血病 DNA含量 细胞周期 图像分析系统
C linical implication ofDNA content assay and cell cycle distribution in
cute leukem ia
LIUAi-Guo, HU Qun, TAO Hong-Fang et al·Department ofPediatrics, TongjiHospital, HUST,
China
〔Abstract〕 Objective:To investigate the distribution ofmarrow cell cycle and the relationshipwith the types o
peutic effects in childhood acute leukemia (AL)·M ethods:Mononuclear cellularDNA contents in bonemarrowwere
nalysis system in 96 patientswith childhoodAL·Results:The proportion ofpatientswith DNA-aneuploidwas differen
ofAL: DNA-aneuploid in the patientswithALLwas 55·7% (44/79), much higher than that in the children withA
17)·Statistically significantdifferenceswere found between the T-ALL group and B-ALL group in the DNA- aneu
vs 41·67%,P<0·05)·The leukemia cell cycle distribution indicated thatG0/G1-phase compartment in untreate
group were higher than in complete remission group and normal controls, G2M+S-phase compartmentwere lower tha
sion group and normal controls (P<0·05)·There were no significant differences in cell cycle distribution between
group and normal controls·Conclusion:The analysis ofAL, especiallyALL aneuploid, by image analysis system can
guishing the high riskALL from the standard riskALL, and the determination of cell cycle distribution can provide a c
for chemotherapy·
〔Key words〕 Childhood leukemia; DNA content; Cell cycle; Image analysis system
细胞DNA含量及细胞周期的变化与白血病发生、发展及
转归有密切的关系。快速分析白血病细胞的动力学变化,可
以评估其增殖能力,初步判断化疗的疗效。研究白血病细胞
的DNA指数和细胞周期的变化,对协助临床诊断和制定个体
化的化疗方案有着重要意义。经典的细胞周期分析方法为流
式细胞仪,但仪器和试剂昂贵限制了其在临床的广泛应用。
笔者采用图像分析系统检测不同病程的儿童白血病细胞DNA
指数、倍体的改变和细胞周期的变化,以及这种变化与临床
的关系,报道如下。
1 资料与方法
1·1 对象及分组 2003年4月~2005年8月儿科血液病房
住院急性白血病(AL) 96例,,男60例,女36例,年龄8个
月~14岁,平均7·1岁。其中急性淋巴细胞白血病(ALL )
79例(初治31例,复发/难治5例,完全缓解43例),急性
非淋巴细胞白血病(ANLL) 17例(初治8例,复发/难治4
例,完全缓解5例)。所有病例均经细胞学及免疫学检查确
诊。
1·2 方法 分别选取不同病程的白血病患儿及正常对照组骨
髓穿刺涂片标本,空气中干燥至少1 h,多聚甲醛固定30 min,
然后进行Feulgen染色〔1〕。采用CMIAS-B图像分析系统测定
细胞核DNA相对含量及DNA指数(DI),同时分析不同细胞
周期的细胞所占百分比。
1·3 DNA倍体判断标准 根据DI判断, DI系样本的G0/G1
期细胞与正常二倍体G0/G1期细胞荧光强度之比。DI正常范
围为0·9~1·1, DI<0·9为亚二倍体, DI>1·1为超二倍体,
亚二倍体和超二倍体均为异倍体。
1·4 统计学方法 应用SPSS 8·0软件,进行χ2检验和t检
验。
2 结果
2·1 DNA异倍体检出情况 79例ALL检出DNA-异倍体
44例,异倍体率55·7%其中48例B-ALL检出异倍体20
例,异倍体率41·67%, 31例T-ALL检出异倍体24例,异
倍体率77·42% ,两个不同免疫类型ALL出现异倍体的阳性
率有显着差异(χ2=9·76, P<0·05)。检出的5例亚二倍体
中,全部为T-ALL。17例ANLL检出异倍体5例,异倍体率
29·41%,与ALL组比较有显着性差异(χ2= 3·84, P<
0·05)。见表1。对照组10例无异倍体检出。
2·2 细胞周期分布 AL初治组患儿的G0/G1(% )明显高
于完全缓解组(t=2·83,P<0·05)和
P<0·05), S+G2/M (% )则明显低于
2·06,P<0·05)和对照组(t=2·74,P<
复发/难治组差异无显着意义(t分别为1·
0·05)。进一步分析ALL组和ANLL组,各
着差异性。见表2。
表1 AL异倍体检出率(
组别初诊缓解
ALL 58·06 (18 /31) 48·84 (21 /43)
B-ALL 55·00 (11 /20) 26·92 (7 /26)
T-ALL 90·91 (10 /11) 64·71 (11 /17)
ANLL 25·00 (2 /8) 20·00 (1 /5)
表2 AL不同病情细胞周期
组别nG0/G1S G
初诊39 89·8±5·3 9·4±8·9 2·7
完全缓解48 72·9±6·5 19·1±10·1 7·4
复发/难治9 83·5±7·1 8·3±5·3 9·4
对照10 70·4±5·4 22·1±4·5 7·3
3 讨论
DNA异倍体是肿瘤的特异性标志已为
体改变在白血病中很常见,国内外均有报
体检出率约为50%〔1〕,本试验79例AL异
与文献报道相符,其中T-ALL异倍体检出
二倍体集中出现于T-ALL中,而B-ALL
41·67% ,明显低于T-ALL。从诊断AL
T-ALL、亚二倍体均作为高危因素,由此
不好与异倍体的出现特别是亚二倍体有关〔
检出率明显高于ANLL组,从遗传学角度
制,表明ANLL患儿的染色体异常较多地
而不是数目异常,这可能是临床ANLL较
因之一〔2〕。
ALL初诊组及难治/复发组DNA异倍
其中难治/复发组与CR组的差异更为显着,
义。随着患者的完全缓解, DNA异倍体率
有部分CR患者存在DNA异倍体。故此类
师重视,以最大限度地延长患者长期生存率
文献记载,白血病细胞的细胞周期比
处于S期和G2M +S期的细胞比例比正
刘爱国等 儿童白血病细胞DNA含量及细胞周期的临床分析 第7期
G2M+S期比例代表该细胞群体中增殖细胞的数量,从另一侧
面反映细胞的增殖状态。本实验显示, AL组患儿骨髓细胞的
G0/G1(% )明显高于缓解组和正常对照组,而S%及S+
G2/M (% )明显低于缓解组和对照组,说明了白血病骨髓细
胞从G0/G1期至S期之间存在运行阻滞,表明白血病骨髓细
胞的增殖能力低于正常。亚二倍体ALL患儿的骨髓细胞增殖
能力低,故预后相对较差。而超二倍体骨髓细胞的增殖分化
需要复制合成更多的遗传物质, S期相对延长,进入S期的细
胞增多,因而临床上对于超二倍体的ALL患儿,联合使用作
用于S期白血病细胞的药物,能达到更佳的治疗效果〔3〕。
故我们认为,在评定AL患者危险度和制定化疗方案时,
除可以MDR作为依据外,患者DNA指数及DNA异倍体率以
及细胞周期分析均可作为重要参考指标。
4 参考文献
1 PuiCH, CristWM, Look ATet al·Biology and
cytogenetic abnormalities in childhood
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2 陈日玲,陈铭珍,蔡康荣et al·流式细胞仪
DNA含量的临床意义·实用儿科临床杂志,
78
3 HirtA, Werren EM, LuethyARet al·Cell cyc
neoplasia ofchildhood: difference among immuno
ilarities in the proliferation ofnormal and leukem
Haemato,l 1992, 80: 189~193
op
9. 细胞周期中存在哪些检验点
在典型的细胞周期中,控制系统是通过细胞周期的关卡来进行调节的.控制系统到少有3个关卡:G1关卡(靠近G1末期),G2关卡(在G2期结束点),中期关卡(在中期末).在每一个关卡,由细胞气息的状态和环境决定细胞能否通过此关卡,进入下一阶段.
现以G2关卡为例,说明细胞周期的调控作用:
当细胞周期进行到G2关卡时,控制系统检测细胞的大小和细胞所处的状态以及细胞内DNA是否复制完毕,如果这些条件合适,就会进入有丝分裂.
10. 细胞周期中有哪些主要检验点
真核细胞分裂周期中决定细胞能否进入下一个时期的监控点，是细胞分裂周期中存在的一种反馈调节机制。
细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点（checkpoint）的严格检控下进行的，当DNA发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断